细胞转染的基本原理和相关技术概述

1、 从分子到细胞，我们如何去思考？DNA的重组 DNA Recombination1.DNA是什么？2.我们这里谈的DNA重组是什么？3.如果我的实验需要重组DNA，我需要什么试剂？4.如何提高重组的效率和成功率？DNA是什么？ 有个小问题，如果我要表达一个蛋白质或者多肽，这一段基因是DNA吗？或是RNA?还是别的什么东西？DNA重组的到底是什么？A.重组的DNA如何获取?a.变出来行不行？b.买一个基因行不行？c.如果是克隆出来的，那怎么克隆？DNA重组是大家实验中的“最笨的机械运动吗？A.显然不是。B.DNA重组与数学，计算机，人的求知欲有没有关系？基因-gene重组DNA技术相关概念（一）

2、DNA克隆 克隆（clone） 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化（cloning）,即无性繁殖。技术水平： 分子克隆（molecular clone） 即DNA克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）内切核酸酶内切核酸酶，维持细菌遗传性状的稳定。限制性内切核酸酶或DNA结合蛋白所特异识别、结合的DNA位点的核苷酸序列，呈二元旋转对称，通常将这种特殊的结构顺序称为回文结构（palindrome）。 识别序列可以是四核苷酸、六核苷酸或八核苷酸；产生的切口可以是粘性末端、平头或钝性末端、配伍末端。 。(三)目的基因 目的基因：用来扩增作研究或生产某一种蛋白质的基因。就

3、是在重组DNA时，人们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的DNA(target DNA)。 类型： cDNA(complementary DNA)：指经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA，经聚合可合成双链cDNA。 基因组DNA(genetic DNA)：指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。感受态细胞：指具备接受外源DNA能力的宿主细胞六）克隆基因的表达表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化、原核表达体系、真核表达体系体外细胞培养物的生长类型 按生长方式:2型 粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于

4、固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 贴附(粘附)型细胞 粘附:是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式含义 两方面结果 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织， 有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面 才能生存和生长。培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞 类型 细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特

5、征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类型 分类 根据形态大致的不同，主要2类： 上皮细胞型 成纤维细胞型 其它，不定型上皮细胞型 名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于-来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核 生长特点 易相连成片 相靠紧密相连成薄层 铺石状 生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动 体外培养细胞类型（1）上皮细胞型成纤维细胞型 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织

6、如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出23个长短不等的突起 中有卵圆形核生长特点 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞细胞接触易断开而 单独行动 游离的单独的成纤维样细胞， 常有几个伸长的细胞突起体外培养细胞类型（2）成纤维细胞型贴附生长型-类型1. 与体内同名的细胞不完全相同 如：形态相似的成纤维细胞，可不同来源 自同一动物不同组织的成纤维样细胞相似但 发展趋向不同2. 培养细胞的形态不稳定 条件改变，细胞形态可有变化 培养细胞形态不稳定血清 Hela 高血清 低血清 成纤维细胞样 上皮样细胞 pH Hela 太酸或太碱 标准pH 成纤维细胞样 上皮样细胞 细胞密度 3T3 低密度 高密度 成纤维细胞样 上皮样细胞 生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮 贴附 圆形 成纤维或上皮样 转化与否 未转化 转化后 成纤维样 可成上皮样 悬浮生长型概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源 自血，脾或骨髓， 尤