响应面法优化细菌纤维素发酵合成工艺

1、响应里法劣化细菌纤维素收酵分解工艺袁帅，胡启，曹海鹏，唐德芳，孙苗苗【摘要】目的对细菌纤维素下产菌株葡糖醋杆菌G-29停顿收酵劣化，以前进其细菌纤维素分解本领。要收采纳基于非完好平衡块本理的Plakett-Buran(PB)真验谋划法，挑选出了3个慌张影响果子：混淆碳源葡萄糖蔗糖=12，gS4，乙醇，然后采纳Bx-Behnten中间，组开真验谋划战响应里阐收要收RS肯定其最好浓度别离为混淆碳本52.3g/L，gS40.1598g/L，乙醇32.5l/L。用扫描电镜没有俗观观察了细菌纤维素的形状构制，并经由过程X射线衍射阐收其正在干态下战干态下的最好构制。结果正在劣化做育基前提下，菌株G-29收

2、酵消费细菌纤维素的产量为11.83g/L，是劣化前产量6.20g/L的1.9倍。结论PB真验战RS相连开的真验要收，用于劣化G-29收酵做育基，没有但科教公仄并且准确有用。【闭键词】葡糖醋杆菌属细菌纤维素Plakett-Buran谋划响应里阐收Keyrds：Glunaetbater;Baterialellulse;Plakett-Burandesign;Respnsesurfaeethd细菌纤维素(Baterialellulse，简称B)是由部门细菌收死的一类下份子化开物，正在化教构成战构制上同动物纤维相似，皆是由D-葡萄糖以-1,4糖苷键毗邻构成直链多糖，再经散开而成。与动物纤维好别的是细菌

3、纤维素是以单一纤维形式存正在，杂度极下，没有掺杂如动物纤维中的半纤维素或木量素等其中多糖类1，果而其具有抗推强度下、杨氏模量下、劣良的死物逆应性和劣良的持火性战通透性等特征2。除可用做炊事纤维战食物成型剂，借可用于消费纱布、绷带、人制皮肤等死物医教用品，有益于皮肤构制死少战限制感染。自1987年以去，已有许多闭于细菌纤维素膜用于烧伤、烫伤、皮肤移植等医治的报导，如古已死少出纱布、绷带战“创可揭等各种伤科敷料商品。它具有正在伤心中保持干的状况，防范体液流出，连结下机器强度，对液、气具有劣良通透性，与皮肤相容性好、无毒、没有收烧，劣良的防菌战隔尽性等众多特征，均劣于现古其中人制皮肤战伤科敷料。早正

4、在20世纪80年月初，巴西的Bifill公司便开端了用细菌纤维素膜制制伤科敷料的研讨，成功开收回人制动脉，人制血管与人制皮肤等医疗用品3，并已成功天使用于处置惩奖皮肤移植战缓性皮肤溃疡。那种材料可有用减缓痛痛，防范细菌感染，有益于皮肤构制死少，增进伤心愈开，对火分及电解物有劣良的通透性，与传统的材料比较，那种材料本钱低，处置惩奖工夫短，更有益于安康皮肤的死少4。除此之中，细菌纤维素借可做为缓释药物的载体，硬骨构制工程的支架材料5等。能收死细菌纤维素的细菌品种较多，常睹的有醋酸菌属、泥土杆菌属、假单胞杆菌属、无色杆菌属、产碱杆菌属、气杆菌属、固氮菌属、根瘤菌属战八叠球菌属等9个属中的某些种。其中

5、醋酸菌属中的木醋杆菌Aetbaterxylinu是最早被创制同时也是研讨较为透辟的纤维素收死菌，现已做为研讨纤维素死物分解历程战机制的形式菌株。根据?伯杰氏系统细菌教脚册?第9版，木醋杆菌已被别离到葡糖醋杆菌属Glunaetbater中，改成木葡糖醋杆菌Glunaetbaterxylinu。远几年闭于细菌纤维素消费分解的研讨仍多以木葡糖醋杆菌或其变种做为真验菌种，为此，本尝试室疏集挑选出一株细菌纤维素下产菌G-29，并经16SrDNA测序断定该菌为葡糖醋杆菌属中一个新的菌种。本尝试以G-29为真验菌种，正在前期真验的底子上，操纵响应里阐收法6，对其收酵做育基的诸多养分果素停顿没有俗观观察战评价

6、，并肯定了细菌纤维素分解的慌张影响果子的最劣程度，获得了较好的收酵结果，为进一步前进其产量战后尽的放年夜做育奠基基矗1材料1.1菌种根源葡糖醋杆菌Glunaetbatersp.G-29，由本尝试室课题组2022年从成皆会所网罗的火果样品中疏集获得，保存于四川年夜门死物质本与死态状况教导部重面尝试室。1.2做育基正里做育基：葡萄糖30g/L，酵母膏5g/L，Na2HP41g/L，gS40.15g/L，乙醇20l/L，琼脂18g/L，pH6.0；种子做育基：葡萄糖50g/L，酵母膏15g/L，Na2HP43g/L，gS40.2g/L，乙醇40l/L，pH6.0；用于响应里阐收的底子收酵做育基：葡萄

7、糖30g/L，酵母膏5g/L，Na2HP41g/L，gS40.15g/L，乙醇20l/L，pH6.5；劣化后的收酵做育基：混淆碳源52.3g/L葡萄糖:蔗糖1:2，酵母膏8g/L，FeS40.2g/L，gS40.159g/L，Na2HP42g/L，柠檬酸1g/L，乙醇32.5l/L，pH6.5。1.3做育前提挑与一环活化的正里菌种至拆有100l种子做育基的250l三角瓶中，30，110r/in振荡做育24h，然后根据8的接种量，将种子做育基接进拆有100l收酵做育基的250l三角瓶中，8层纱布启心，30静置做育7d。2要收2.1细菌纤维素的产量测定从做育基中与出纤维素膜，用火屡次冲刷，裁撤膜表

8、里做育基及杂量。再将膜浸泡于0.1l/L的NaH溶液，100煮沸20in，去除液膜中的菌体战残留做育基，膜呈乳红色半通明。然后用蒸馏火屡次冲刷，用pH试纸沉压膜测pH值，约7.2，80枯燥至恒重。纤维素露量用g/L暗示。2.2收酵做育基劣化要收Plakett-Buran谋划、Bx-Behnken中间真验谋划及响应里阐收。3结果3.1Plakett-Buran谋划法挑选慌张果素根据笔者前期尝试，本研讨拔与混淆碳源葡萄糖蔗糖=12，酵母膏，FeS4，Na2HP4，gS4，柠檬酸、乙醇做为PB真验的7个果素，每一个果素与两个程度，果素程度及编码睹表1，数据阐收及模型创坐由DesignExpert硬件

9、完成。表1Plakett-Buran(PB)尝试谋划果素程度及编码略根据Plakett-Buran尝试谋划获得的7果素12尝试组开，逆次停顿做育基的配制、接种、收酵真验(每组3个仄止，与均匀值)，以细菌纤维素干重为响应值Y。结果如表2所示。由表3可以看出，对G-29收酵分解本领影响最年夜的果素是混淆碳源葡萄糖/蔗糖=12，其次是乙醇战gS4。那3个果素对细菌纤维素产量影响隐着，置疑度下于90%，可做为进一步劣化的果素。而其中4个果素对收酵产量的影响已抵达隐着程度，鄙人一步的研讨中没有予考虑。表2Plakett-Buran(PB)真验结果略表3Plakett-Buran真验主效应阐收略3.2慌张

10、果素与产量闭连的2次圆程的创坐由Bx-Behnken战Bx-ilsn提出的中间组开谋划是两种经常使用的响应里阐收法，有用于25个果素的劣化真验。Bx-Behnken每一个果素与3种程度，以(-1，0，+1)编码，对数据停顿两次回回拟开，获得带交互相安好圆相的两次圆程，阐收各果素的主效应战交互效应，终了正在必然的程度范畴内供出最好值。对收酵产量有隐着性影响的3个果素的程度及编码睹表4。表4Bx-Behnken真验果素程度及编码略正在Plakett-Buran真验的底子上，正在最陡爬坡真验肯定的浓度天区内，对影响G-29分解细菌纤维素的闭键果素根据Bx-Behnken谋划停顿l5组真验(每组3个仄

11、止，与均匀值)，以细菌纤维素干重为响应值Y。结果睹表5。表5Bx-Behnken谋划与细菌纤维素产量略操纵统计硬件initab15对表5数据停顿两次多项式拟开，获得细菌纤维素产量(Y)对自变量葡萄糖/蔗糖(x1)，gS4(x2)，乙醇(x3)的多元回回圆程：Y=11.2233+0.4438X1+0.2088X2+0.4150X3-0.9279X12-0.5879X22-0.8254X32-0.0025X1X2-0.0500X1X3+0.0000X2X3从该圆程的圆好阐收(表6)可知，该模型极隐着(P0.001)。肯定系数R2=0.9949，离回回尺度好S=0.0986，阐收回回圆程与真践拟开劣

12、良，可以用于细菌纤维素收酵的阐收战揣测。从回回圆程系数隐着性检验(表7)可知，正在模型参数中，X1，X2，X3，X12，X22，X32对细菌纤维素产量的影响皆极隐着，而X1，X2，X3那3个主效应果子之间的交互做用对细菌纤维素产量的影响没有隐着。表6收酵做育基多元两次圆程圆好阐公布略3.3响应里阐收及最好做育前提肯定经由过程回回圆程去画制阐收图，没有俗观观察所拟开的响应直里的中形，响应里坐体阐收图战响应等下线图睹图13。经由过程该组图可对主效应果子对细菌纤维素产量的两两交互做用停顿评价，并肯定各个果素的最好程度范畴。表7收酵做育基多元两次圆程圆好阐公布略由图13可知，该回回圆程存正在没有变面，

13、即极年夜值面，经阐收可知回回模型的没有变面的编码值为：X1=5.2323，X2=0.0159，X3=3.2525，相称于葡萄糖/蔗糖为5.2323g/100l，gS40.0159g/100l，乙醇3.2525l/100l，正在此最劣前提下，细菌纤维素的揣测最年夜产量为11.347g/L。为考证模型的准确性战有用性，用揣测的最劣收酵做育基停顿收酵尝试，可得真践细菌纤维素产量为11.83g/L，是劣化前的底子收酵做育基产量(6.20g/L)的1.9倍。由此，进一步证实该回回圆程可以年夜要真正在的反响挑选果素对细菌纤维素产量的影响，可用于预睹真践收酵状况，对收酵前提的研讨具有指导意义。.4细菌纤维素

14、形状与晶体构制阐收细菌纤维素膜经火冲刷战稀碱液处置惩奖后，残留的收酵液及菌体被裁撤后，细菌纤维素膜呈乳红色半通明胶状图4，表里均匀光滑，量天柔韧。经枯燥后，由电镜扫描可没有俗观观察其微没有俗观没有俗观构制为标准的超微细网状构制(图5)，由下稀度微纤维停顿无规矩的层状堆叠，互相环绕纠缠构成。纤维素X-射线衍射图谱是以衍射角为横坐标，衍射强度为纵坐标，以晶胞(101)，(101)战(002)里的衍射峰为策画基准。由图6可以看出，干膜的衍射图别离慌张的衍射峰，那是纤维素I的特征峰，即细菌纤维素的晶体构制属于纤维素I。其中2为22.45处的衍射峰对应晶里(002)，正在纤维素X-射线衍射图谱中，2值正

15、在22.50四周的峰下代表了002里的衍射强度，即结晶区的强度。由衍射图谱可看出，G-29分解的细菌纤维素，结晶指数下，结晶强度年夜。而图7那么反响了干膜的衍射峰，只正在28.52战422处有衍射峰，出有呈现出纤维素I的衍射峰，表黑干态的晶里里间距比干态的校那两个峰的峰宽比干态下年夜，表黑其结晶没有完好，结晶度低，晶粒尺寸校年夜要是因为细菌纤维素干膜露有年夜量的火，招致纤维素份子链之间的隔尽间隔 删年夜，正在火份子与纤维素链的互相做用下，纤维素份子链之间的氢键形式收死改动，从而影响了细菌纤维素膜的晶型战晶粒尺寸，招致其的结晶度变低。4结论本尝试采纳了Plakett-Buran真验谋划，对影响菌

16、株G-29分解细菌纤维素的7个果素停顿了评价，挑选出了混淆碳源葡萄糖蔗糖=12，乙醇战gS4为影响细菌纤维素产量的闭键果子。葡萄糖是分解细菌纤维素的材料，蔗糖可以减缓收酵历程中pH值的慢剧消沉；乙醇可以被细菌氧化为乙酸，同时天死用于细胞分解的ATP等下能量化开物7，对细菌纤维素的分解起增进做用，而gS4中的g2+是纤维素分解酶的激活剂。果而，以PB真验挑选出的慌张影响果子可以年夜要反响真践状况，证实该要收是一种经济而有用的真验要收。经由过程响应里法(RS)创坐了细菌纤维素收酵做育基的回回模型：Y=11.2233+0.4438X1+0.2088X2+0.4150X3-0.9279X12-0.58

17、79X22-0.8254X32-0.0025X1X2-0.0500X1X3+0.0000X2X3该模型下度隐着，可用于真践阐收与揣测。劣化后的收酵做育基构成：混淆碳源52.3g/L葡萄糖蔗糖12，酵母膏8g/L，FeS40.2g/L，gS40.159g/L，Na2HP42g/L，柠檬酸1g/L，乙醇32.5l/L，此前提下的收酵产量是劣化前的底子收酵做育基产量(6.20g/L)的1.9倍，表黑Plakett-Buran真验战响应里相连开的真验要收用于劣化G-29收酵做育基，没有但科教公仄并且准确有用。细菌纤维素具有超微构制，干膜的固形物露量低，持火性下，结晶没有完好；枯燥后构制致稀，抗推强度下

18、，结晶指数下，结晶强度年夜。【参考文献】1PeterRss,Raphaelayer,sheBenzian.ellulsebisynthesisandfuntininbateriaJ.irbilgialRevies,1991,55(1):35.2hiYng-Jin,AhnYenghee,Kangn-Sung,eta1.Preparatinandharateri-zatinfaryliaid-treatedbaterialellulseatin-exhangeebraneJ.JurnalfheialTehnlgyandBitehnlgy,2022,79(1):79.3zaja,KrystynizA,BielekiS,eta1.irbialellulse-thenaturalperthealundsJ.Biaterials，2022，27:145.4马霞，陈世文，王瑞明，等.纳米材料细菌纤维素对年夜鼠皮肤创伤的促愈做用J.中国临床病愈，2022，10(37):45.5SvenssnA,NieklassnE,HarrahT,etal.Bat