植物发育生物学研究方法市公开课金奖市赛课一等奖课件

1、植物发育生物学研究方法第1页2发育生物学遗传学生物化学细胞学生理学分子生物学免疫学发育生物学在生命科学中地位第2页植物发育生物学惯用研究方法及原理突变体库构建基因缄默（RNAi）蛋白质互作研究第3页突变体诱导与选择正向遗传学第4页突变体诱导与选择伴随大量物种全基因组序列测序完成，对基因研究进入了以功效基因组学为代表后基因组时代。功效基因组学是在结构基因组学丰富信息资源基础上，利用植物全基因组序列信息，应用各种试验方法并结合统计和生物信息学方法研究和分析基因表示、调控与功效以及植物生长、发育规律学科。要了解植物体内各基因生物学功效，怎样协调发挥作用，参加一系列生长发育过程，就需要我们准确了解每个

2、基因功效及基因间相互作用；构建基因突变体库，经过突变体分析判定基因功效是一个最直接最有效分析判定基因功效方法。第5页突变体诱导与选择突变体能够经过植物自发突变产生，不过研究中经常经过人为伎俩诱导取得突变体。普通来说，单个植株自发突变频率介于千分之一至万分之一，单个基因自发突变频率则介于十万分之一至百万分之一。除了自发突变外，体细胞无性系也会产生突变体。不过最常见突变体还是经过人工诱变方法产生，如理化诱变突变体和插入突变体。自发突变是在自然条件下发生突变，是生物变异主要起源和自然进化基础。不过自发突变频率较低，而且许多突变经常是致死型或经过表型无法判定而无法取得，所以系统搜集自发突变体存在很多困

3、难。即使取得感兴趣突变体，分离突变体基因和判定其功效也是比较困难。第6页突变体选择概念 组织培养筛选突变体方法，又称离体筛选。组织培养过程中表现出变异，体细胞无性系变异在培养基中加选择压（化学物质）诱导产生变异，含有定向突变特征。 植物细胞工程当前分为五个分支：脱毒与快速繁殖。细胞大量培养。体细胞杂交。细胞遗传转化及产生转基因植株。无性系变异与分离突变体。 后三者则主要利用遗传变异，创建新种质。第7页 离体筛选优点：离体筛选突变体可控程度高，便于进行定向选择。突变频率高，筛选群体大，在较小容器中可操作百万到千万个植物细胞。 离体筛选意义：对农作物形状进行遗传改良；为细胞杂交和转基因技术提供选择

4、标识，如互补选择；对突变体细胞进行遗传及生理代谢研究。突变是遗传变异性终极起源，它为种群变异提供原材料。是表达生物多样性和适应多变环境主要方式。第8页二、变异类型1. 农作物品质改良食品营养价值主要取决于种子中蛋白质和氨基酸含量，尤其是氨基酸组成和含量。谷类作物中多数作物赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸含量偏低，而在一些豆类作物中蛋氨酸偏低。如赖氨酸含量在玉米中约为0.3%，小麦在0.34%左右。作物体内一些特定氨基酸在细胞内保持一定浓度，过高回发生毒害作用。而一些细胞一旦取得对这些氨基酸抗性后，可大大减轻这些毒性，从而允许细胞内这些氨基酸及类似物过量积累，这些氨基酸可能就是对人们尤其有用氨基酸。如取

5、得高赖氨酸细胞系突变植物类型，就可到达改良品种目标。第9页2.抗病突变体 当病原菌侵染植物组织后往往会产生一个毒素，破坏寄主细胞正常代谢，严重甚至造成细胞死亡。病原毒素普通为一些次生产物，如糖苷、萜类、酚类或氨基酸类似物等。在培养基内加入某种病原毒素可淘汰不抗病细胞，筛选出能够抗病细胞。第10页3 抗逆突变体耐盐突变体筛选是经过在培养基中加入高盐浓度，甚至海水来进行。在盐浓度逐步增加条件下，诱导并筛选出耐盐细胞系。Dix和Steet（1975）利用加入NaCl液体培养基，培养辣椒和烟草，结果得到一个可在含1%2% NaCl条件下生存抗盐突变细胞株，培养几代在回到含盐培养基中，仍含有抗盐性。在抗

6、盐细胞中游离脯氨酸积累量增加，表明脯氨酸与植物抗盐性关系。Dix和Steet用辣椒愈伤组织细胞进行悬浮培养，用甲基磺酸乙酯（EMS）作为诱变剂，在0-3条件下，得到两个抗低温突变细胞系。抗UV植物细胞克隆第11页三、变异起源 1 .离体培养细胞自发突变 组织培养后植株变异原因： 组织培养过程中引发可遗传变异。植株再生方式、生长调整物质、继代培养时间。 由外源遗传及生理作用引发变异植物细胞、组织、在离体培养时，因为环境条件能够人为控制和培养基中化学原因影响，会发生各种各样变异，外植体体细胞发生变异称为体细胞变异第12页体细胞无性系变异特征表现在：随机性，无法准确地分批重复。再生植株遗传变异性广，

7、包含染色体变异，畸变，点突变，转座，以及线粒体和叶绿体基因组改变等。第13页2. 人工诱发突变物理方法：主要有X射线，r射线处理，32P、14C等。有时用热中子或快中子处理。物理诱变好处是，使用方便，洁净，穿透力强，重复性好，突变频率高，但需专门设备。化学诱变：在组织培养中惯用化学诱变剂处理，好处是不需专门设备，操作方便，因为处理材料是组织块、细胞团、游离单细胞或原生质体，所以能够在一定程度上克服化学诱变剂穿透力差缺点。所以对培养组织进行诱变，当前较多采取化学诱变剂。用各种诱导剂处理能够提升突变频率10100倍，下面介绍植物组织培养诱变中惯用诱变剂种类和使用方法。第14页烷化剂甲基磺酸乙酯（E

8、MS）、甲基磺酸甲酯（MMS）、乙基磺酸乙酯（EES）、乙烯亚胺（EI）、亚硝基乙基脲（ENH）等。烷化剂是栽培作物中诱发突变极其主要一类化学诱变剂，它带有许多活烷基，烷基能够转移到其它分子中电子密度极高位置上去，这种经过烷基在分子内置换作用称为烷基化作用。这些物质经过磷酸基、嘌呤、嘧啶基烷化而与DNA作用，最终引发遗传物质破坏、修复与错误修复各种酶促反应而发生变异。 第15页亚硝基胍（NTG，N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍）是已知最强化学诱变剂，在适当条件下可产生很高突变率，而致死率较低，利用浓度不一样可控制突变率高低，惯用浓度为1050g/ml。用这种化学诱变剂处理后，经过离心或微孔滤膜

9、过滤方法搜集细胞，然后用水或培养液洗涤后植平板。叠氮化物是在常规诱发突变中对植物诱变效果最好一个诱变剂，在诱发大麦、豌豆、小麦、水稻等作物上都能取得高诱变率。对大麦叶绿素缺失突变体诱变效果，比射线和中子诱导率高，对人毒性小，对植物引发损伤也小。射线和中子诱变率为10%，叠氮化钠诱变率为40%50%。第16页四、突变体选择方法 1.直接选择法 通常是把细胞培养在一个亲本细胞不能生长培养基上，或亲本细胞死亡培养基上，即施加选择压。经诱变或未经诱变培养组织都可用增加选择压抑制未突变细胞生长化学物质方法进行选择。在培养基中施加不一样选择压能够对所需要性状进行定向选择。 如以抗植物毒素（选择压）选择抗病

10、性，以高浓度盐选择耐盐性，以高浓度除草剂或农药选择耐药性，以某种代谢中间产物为选择压筛选高氨基酸、高糖优质谷物新品种。比如，要分离某种除草剂有抗性突变体，首先是把培养材料接种在含一系列浓度除草剂培养基上，测定最低开始抑制生长浓度。对能深入生长组织能够在含一系列浓度除草剂培养基上进行在培养，以确定其耐药最高极限浓度。第17页定向基因突变T-DNA插入突变转座子插入突变第18页T-DNA插入法主要是利用农杆菌Ti或Ri质粒中一段转移DNA序列，从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组中。因为农杆菌转化技术成熟和广泛使用，所以经过大量T-DNA独立转化子建立T-DNA插入突变体库，是一个快速构建插入突变

11、体库方法之一。以拟南芥为例，当前为止，已经构建了22500多个拟南芥T-DNA插入突变体，取得约360000个T-DNA插入位点序列，几乎涵盖了拟南芥整个基因组，使得研究和分析植物生长发育过程中各个相关基因功效成为现实。转座子插入法主要是利用来自于玉米Ac和Ds转座子能在植物基因组中跳动，且跳动后经常以高频率在原位点附近再插入从而破坏原位点周围基因为原理。当前经过转座子插入系统已经取得各种包含植物和微生物在内各种突变体库，为分析基因在植物生长发育过程中发挥功效提升大量材料。第19页基因缄默反向遗传学第20页基因缄默概念及发觉基因缄默（Gene silencing）是指生物体中特定基因因为种种原

12、因不表示或者是表示降低现象。基因缄默现象首先在转基因植物中发觉，接着和线虫、真菌、昆虫、原生动物以及才鼠中陆续发觉。大量研究表明，环境因子、发育因子、DNA修饰、组蛋白乙酰化程度、基因拷贝数、位置效应、生物保护性限制修饰以及基因过分转录等都与基因缄默相关。 第21页RNAi发觉 20多年前，在对矮牵牛（petunias）进行研究中有个奇怪发觉：Rich Jorgensen和同事将一个能产生色素基因置于一个强开启子后，导入矮脚牵牛中，试图加深花朵紫颜色，结果没看到期待中深紫色花朵，多数花成了花斑甚至白。Jorgensen将将这种现象命名为协同抑制“cosuppression”，因为导入基因和其相

13、同内源基因同时都被抑制。以后发觉在其它许多植物中，甚至在真菌中也有类似现象。野生型试验预测第22页RNA interference 1995，RNAi现象首次在线虫中发觉。1998，RNAi概念首次提出。1999，RNAi作用机制模型提出。在线虫、果蝇、拟南芥及斑马鱼等各种生物内发觉RNAi现象。，RNAi技术成功诱导培养哺乳动物细胞基因缄默现象。RNAi 技术被Science评为十大科技进展之一。至今，蓬勃发展，成为分子生物学领域最为热门方向之一。第23页1995年，Guo S等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中par-1基因表示。设计： 反义RNA 特异性地阻断par-1基因

14、表示； 正义RNA 以期观察到基因表示增强。结果: 二者都一样地切断了par-1基因表示路径。这是与传统上对反义RNA技术解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合了解释。 第24页RNAi提出直到1998年2月，Fire A和Mello C才首次揭开这个悬疑之谜。他们将体外转录得到单链RNA纯化后注射线虫时发觉，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化双链RNA却恰好相反，能够高效特异性阻断对应基因表示。他们证实，Guo S博士碰到正义RNA抑制基因表示现象，以及过去反义RNA技术对基因表示阻断，都是因为体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引发。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA

15、interference， 简称RNAi）。 第25页RNAi广泛存在于自然界随即，RNAi现象被广泛地发觉于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化早期阶段。伴随研究不停深入，RNAi机制正在被逐步说明，而同时作为功效基因组研究领域中有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。 第26页RNAi定义 当前对RNAi (RNA interference)定义有很各种，假如将RNAi看作一个生物学现象，能够有以下定义： RNAi是由dsRNA介导由特定酶参加特异性基因缄默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因表示。 RNAi是

16、有dsRNA参加指导，以外源和内源mRNA为降解目标转基因缄默现象。含有核苷酸序列特异性自我防御机制，是一个当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源基因发生共同基因缄默现象。 第27页假如将其作为一门生物技术，则定义为 ： RNAi 是指经过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因现象,它经过人为地引入与内源靶基因含有相同序列双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因mRNA 降解,到达阻止基因表示目标。 RNAi是指体外人工合成或体内双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性将与之同源 mRNA降解成21nt23nt 小片段，使对应基因缄

17、默。 RNAi是将与靶基因mRNA 同源互补双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生对应功效表型缺失, 属于转录后水平基因缄默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。 RNAi定义 第28页RNAi 机制 第29页RNAi作用简单模型当dsRNA导入细胞后，被一个dsRNA特异核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长小片段，这些片段可与该核酸酶dsRNA结合结构域结合，而且作为模板识别目标mRNA。识别之后，mRNA与dsRNA有义链发生链交换，原先dsRNA中有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放

18、出来，而mRNA则处于原先有义链位置。核酸酶在一样位置对mRNA进行切割，这么又产生了21-23核苷酸长dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目标mRNA进行切割，从而使目标基因缄默，产生RNAi现象。第30页RNAi引发基因缄默机制Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, .第31页RNAi在植物与其它生物中差异 在植物中存在系统性缄默(systematic RNA silencing)现象，RNAi不会局限于单个细胞内，能够在细胞与细胞之间、甚至由诱导部位向更远组织传输。植物中存在转移性缄默(transitive RNAi)，对于转基因植

19、物中外源基因，假如dsRNA诱导RNA缄默区域对应于基因中间区域，能检测到与其侧翼区段对应siRNA。但内源基因却缺乏转移性缄默，表现出缄默区域保守性。这两种现象在线虫中也有发觉,但在哺乳动物和昆虫中却没有发觉类似现象。植物中RNAi跟两种不一样大小siRNA相关：21nt和24ntsiRNA，21nt由RISC指导切割目标mRNA，而24nt则引发了系统性缄默和甲基化；而在动物中仅发觉21ntsiRNA。 第32页RNAi研究普通技术路线第33页RNAi效果分析可从mRNA和蛋白质两方面进行。mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern 杂交等。蛋白质：Western杂交；ELISA

20、；免疫荧光等。细胞代谢过程，生理生化系数等表型参数改变是RNAi效果最终和最大表达。第34页RNAi在植物功效基因组研究中应用 RNAi为大规模高效及复杂功效基因组学研究提供了一个便捷平台 。Chuang等在花发育研究中采取RNA缄默技术验证了AG、CLV3、APl、PAN等已知功效基因,并开创了RNA缄默技术在植物功效基因组学中应用 。Miki等利用水稻OsRac基因家族保守性序列设计RNA缄默载体，成功对OsRac基因家族进行了缄默，发觉该突变株系生长情况和植株高度均比正常要差，揭示该基因家族在生长发育过程中有主要作用 第35页RNAi在作物品质改良中应用 尽管产量问题在传统育种和植物遗传

21、工程研究中是最主要目标,改进植物营养价值方面也越来越受到重视。常规育种方法在改进食物营养方面取得了卓有成效成功，然而操作耗时，而且对于作物性状改良只限于已经得到突变体材料 而利用RNA缄默技术，其优越性不但表现在可操作基因范围和突变种类扩大了，而且对目标基因表示有了可控性 第36页利用RNA缄默产生抗病毒植物 将病毒某一序列设计成双链结构导入植物体使之表示,可诱发RNA缄默强化植物体内天然RNA缄默抗病毒能力，这使得高抗病毒性转基因植物取得成为可能 。Waterhouse等利用马铃薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段构建IRS载体进行烟草转化，取得抗性植株。Wang等利用含有大麦黄矮病毒(Barl

22、ey yellow dwarf virus，BYDV)PAV株系复制酶基因片断构建成可产生发夹式RNA结构载体，并将该载体导入大麦得到强抗性植株并得到稳定遗传 第37页内源RNAi第38页蛋白质相互作用研究技术 第39页蛋白质之间相互作用以及经过相互作用而形成蛋白复合物是细胞各种基本功效主要完成者。几乎全部主要生命活动，包含DNA复制与转录、蛋白质合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间相互作用。 蛋白质之间相互作用研究主要性第40页酵母双杂交谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验(GST-pull down）免疫共沉淀双分子荧光互补技术(BIFC)生物发光共振能量转移（BRET）技术惯用蛋白

23、质相互作用研究技术第41页一、细菌双杂交系统 Two-hybrid system 是90年代初发展起来新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用基因。基本原理： 真核生物转录因子大多是由两个结构上分开、功效上独立结构域组成,如GAL4 （酵母转录激活蛋白Gal4基因）。这两个结构域各具功效，互不影响。但一个完整激活特定基因表示激活因子必须同时含有这两个结构域，不然无法完成激活功效。第42页 酵母激活因子 GAL4：N端：147个氨基酸组成DNA结合域(BD)， C端：113个氨基酸组成转录激活域(AD)。GAL4分子DNA结合域能够和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转