甘露聚糖酶活力的测定

1、甘露聚糖酶活力的测定、原理甘露聚糖酶能从底物LBG（Gum, Locus Bean洋槐豆粉）中水解产生还原糖。还原糖的产 生量与酶活性成正比，用DNS显色法测定还原糖的含量，从而计算出酶活力。二、酶活力单位（U）的定义在40C、pH 6.0的酶活力测定条件下，1min催化5mg/mL LBG底物溶液生成1艇还原 糖（以甘露糖表示）所需的酶量定义为一个酶活力单位U）,其中样品的酶活力以U/g （固 体酶）或U/mL （液体酶）表示。三、主要仪器3.1紫外可见分光光度计3.2电子天平：感量0.0001g3.3恒温水浴锅3060C可调，精度为0.1C。3.4 pH计：精确至0.013.5秒表：每小时

2、误差不超过5s。3.6 离心机：3000-4000g3.7移液器：1-5mL可调，精度川L。四、试剂与溶液配制除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。4.1 0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O） 45.23g，柠檬酸8.07g，溶于900mL蒸馏水 中，用0.2M NaOH溶液或0.2M HCL溶液调至pH6.0，加蒸馏水定容至1.0L，混匀。4.2氢氧化钠溶液（200g/L）：称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。DNS 试剂：称取3,5-二硝基水杨酸3.15g （化学纯），加水5

3、00mL，搅拌5s，水浴至45C。然后逐 步加入100mL氢氧化钠溶液（4.2），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢 氧化钠过程中，溶液温度不要超过48C）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g 和无水亚硫酸钠2.50g。继续45C水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物 质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取 滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。LBG （洋槐豆粉）底物溶液，浓度10mg/mL：准确称取1.00gLBG （洋槐豆粉，Sigma G0753），徐徐加入90

4、mL 0.05M pH6.0磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液（4.1）中，磁力搅拌缓慢加热，直至LBG完全溶解。然后停止加热，继 续搅拌30min。冷却后，用0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）定容至100mL， LBG底物溶液能立即使用，使用前适当摇匀。此溶液标记为10mg/mL LBG底物溶液pH6.0， 4C避光保存，有效期为3天。10mg/mL甘露糖标准液称取无水甘露糖1.000g （应在105C烘至恒重的，一般2h），用pH6.0磷酸氢二钠-柠檬 酸缓冲液（4.1）溶液，定容于100mL。五、标准曲线的制作分别吸取 10mg/mL 甘露糖标准液（4.5）0，1.0，2.

5、0，3.0，4.0，5.0，6.0mL 于 100mL 容量瓶中，用pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）稀释至刻度，得到0，100，200，300， 400，500，600gg/mL的标准稀释液。取不同浓度稀释液各2mL于试管中，加2mL pH6.0磷 酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1），DNS试剂（4.3） 5mL，于沸水浴沸腾5min （样品放入从新 沸腾计时），取出后立即用自来水冷却至室温，并加入蒸馏水定容至25mL，混匀，以不含 甘露糖的为空白，在540nm处分别测定其吸光度OD值，记录OD值。以吸光度OD值为横坐标，以相应甘露糖浓度为纵坐标，绘制出标准曲线或作回归方程 （R2

6、值要大于0.998才能使用，否则应重做）。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲 线。六、测定步骤6.1待测酶液的制备固体酶样：准确称取1g样品（微丸酶应先粉碎），精确至0.0001g置于100mL容量瓶 中，加入约70mL 0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1），在磁力搅拌器上高速搅拌 20min（这很重要，抽提时间不足对酶活影响很大），用0.05MpH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲 液（4.1）定容至刻度（减去磁力搅拌棒的体积），摇匀，在离心机上以4000r/min离心10min， 取1.0mL上清液用0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）作适当稀释（吸

7、光度OD 值在0.2-0.4之间），等待反应。液体酶样：吸取5mL液体酶在离心机上以4000r/min离心10min，取1.0mL上清液用 0.05M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（4.1）定容至100mL作为待测酶液（用前作适当稀 释；吸光度OD值在0.2-0.4之间），等待反应。6.2 测定6.2.1 吸取 10.0mL 10mg/mL LBG底物溶液（4.4），40C平衡 10min。吸取10.0mL经过适当稀释的待测酶液，40C平衡10min。6.2.2酶空白样的制备吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过40C平衡），加入到刻度试管中，再加入5mL DNS试剂（4.3），振荡

8、3s。然后加入2.0mL LBG底物溶液（4.4），40C保温20min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，振荡3s。以此作为下步反应 空白调零样。6.2.3酶反应样吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过40C平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0mL LBG底物溶液（4.4）（已经过40C平衡），振荡3s，40C精确保温20min。加入5.0mLDNS试剂（4.3），振荡3s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，混匀。以酶空白样（6.2.2）为空白调零，在540nm出测定吸光度OD值。 需做2个平行。查标准曲线或回归方程式，求出样品中还原糖量。OD值以在0.2-0.40范围为宜，若不 在此范围需改变稀释倍数后再做。七、结果表示与计算按式（1）(1)