实验1细胞培养概述

1、 实验1细胞培养概述一）细胞培养室的设置和无菌操作【实验原理】细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。三室既相互连接又相对独立，各自完成培养过程中的不同操作。【实验目的】了解培养室的设置和设备。学习无菌概念和无菌操作要领。【操作步骤】1实验室设置（1）配液室（2）准备室（3）培养室培养室内要完全密闭，保持恒定的温度，在设计上要注意以下几点：培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照射的地方，防止室内温度增高。天花板的高度不要超过2米，以保证紫外灯的有效杀菌效应，门一般用拉门，以防止空气流动。

2、天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。2实验室常用设备（1）准备室的设备双蒸馏水蒸馏器：制备双蒸水。酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。干燥箱：洗涤完的玻璃器皿用干燥箱烘干。高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。不同物品其有效灭菌压力和时间不同。储品柜1：放置未消毒物品。储品柜2：放置已消毒物品。准备室注意事项：预防蒸馏器被烤干。勿将酸液溅到衣物或地面。勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。（2）配液室的设备天平（扭力天平和电子天平）：称量用pH计。磁力搅拌器。（3）细胞培养室的设备超净工

3、作台：超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其工作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，徐徐通过台面，这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。根据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，基本原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。但两种净化台的气流方向不同。使用超净工作台应注意的几点问题：A净化工作台最好安装在无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命。新安装的或长期未

4、使用的工用台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。每次使用工作台时，应先用75%酒精擦洗台面，并提前以3050min紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。在关闭紫外灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。D净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰。般情况下，高效过滤器三年更换一次。更换高效滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。要定期将粗过滤器中的过布（无纺布）拆下清洗，时间应根据环境洁净程度而定，通常间隔36个月进行一次。每次使用净化台要及时清除工作台面上的物品，并用洒精擦洗台面使之始

5、终保持洁净。4C冰箱和低温冰箱：CO2培养箱：A.定浓度的CO2对细胞生长，尤其是原代培养和单细胞培养有促进作用（5%）。定浓度的CO2可维持培养液恒定的pH。适用于开放培养，培养箱封后，可在一般恒温培养箱内培养，但是采用培养皿或多孔板培养时，则需要高湿度和高CO2含量的空气。它增加了湿度，箱体内装有水浴，可以保证培养箱内的湿度。D.培养箱内装有紫外灯。通过气体流量计可以调节CO2和空气的比例。在水中可加入防腐剂（二氧乙酸）。可防止因CO2培养箱中湿度较高，易长霉菌。离心机：CO2钢瓶：液氮罐：储品柜：用来存放杂物紫外灯：空气净化系统倒置显微镜3无菌操作（1）无菌室的灭菌：紫外灯无人时就要打开

6、；进无菌室要穿无菌服、戴帽子和罩；每周清洗消毒一次；所用物品要以外科手术方式严格消毒；室内台面要要保持洁净，做完实验后，用75%酒精或千分之三新洁尔灭棉球擦拭超净工作台的台内、边台的台面、倒置显微镜的载物台等；所用物品要一次性准备好；瓶要用酒精火焰消毒；尽量减少出入。（2）实验人员的无菌准备：肥皂洗手穿好隔离衣酒精棉球擦手【实验报告】画出一个标准细胞培养室的草图，标明各室的必须设备。【思考题】1观看演示填写出无菌操作的要领。2在无菌室工作时应注意的事项是什么？3实验过程中如何才能在头脑中形成良好的无菌概念？（二）器械的清洗与消毒【实验原理】在组织培养过程中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒

7、性物质包括解体的微生物及细胞残余物以及非营养的化学物质，因此对新采用和重新使用的培养皿等培养用品都要严格清洗和消毒。【实验目的】学习并掌握细胞培养使用的器皿、器械的洗涤和消毒。【仪器、材料及试剂】1仪器：超净工作台，干燥箱，高压锅，过滤器。2材料：0.22例微孔滤膜。3试剂：75%酒精，0.1%新洁尔灭，高锰酸钾，重铬酸钾，浓硫酸。【操作步骤】1清洗（1）玻璃器皿的清洗步骤：按浸泡一刷洗一浸酸一冲洗等四步程序进行。浸泡：新购进的玻璃器皿常带有灰尘，呈弱碱性，或带有铅、碑等有害物质，故先用自来水浸泡过夜、水洗，然后再用2%5%盐酸浸泡过夜或煮沸30min，水洗。要领：培养用后的玻璃器皿要立即泡入

8、清水中，使下道刷洗工作能顺利进行。用后的玻璃器皿常带有大量的蛋白质附着，干涸后不易刷洗掉，用后要立即用清水浸泡。刷洗：用软毛刷、优质洗涤剂，刷去器皿上的杂质，冲洗晾干。要领：浸泡后的玻璃器皿用毛刷沾洗涤剂去器皿上的杂质、刷洗次太多，会损害器皿的表面光洁度，洗涤剂有使pH上升的趋势，所以易选用软毛刷和优质洗涤剂。禁止用去污粉。因其中含有砂粒。会严重破坏玻璃器皿的光洁度。特别注意刷洗瓶角部位。酸浸之前要把洗涤剂冲干净。浸酸：将器皿浸泡于清洁液24h，如急用也不得少于4h。清洁液由重铬酸钾、浓硫酸及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强。经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的末刷洗掉的微量杂质可被

9、完全清除。冲洗：先用自来水充分冲洗，吸管等冲流10min，瓶皿需每瓶灌满、倒掉，反复10次以上。然后再经蒸馏水漂洗3次，不留死角。晾干或烘干备用。对已用过的器皿，凡污染者必先经煮沸30min或放3%盐酸中浸泡过夜，未污染者可不需灭菌处理，但仍要刷洗、清洁液浸酸过夜，冲洗等。【附】清洁液的配制和使用注意事项1.清洁液（配方见表2-1）配方成分弱酸次强液强液重铬酸钾（g）5010060清水（ml）10001000200浓硫酸（ml）90160800硫酸浓度（v/v）8%14%80%选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜。先将重铬酸钾溶于水（用玻璃棒搅拌助溶，有时不能完全溶解）。缓缓加入浓硫酸，切忌过急，

10、否则将产热而发生危险（绝不可将重错酸饵液倒入浓硫酸中）。清洁液配好呈棕红色，待变绿色时表明失效。由于清洁液的腐蚀性极强，配制与应用时必须小心，并做好防护。2矽酸钠洗液贮存液（X100）砂酸纳80克加偏磷酸钠9克加热溶在1000ml水中。使用时用水稀释100倍，将器皿放入煮沸20min，冷却后冲洗，再用2%HCl浸泡2h后，自来水冲洗。矽酸钠洗液较清洁液安全，但价格较贵。（2）塑料器皿清洗自来水充分浸泡一冲洗一2%NaOH浸泡过夜一自来水冲洗一2%5%盐酸浸泡30min-自来水冲洗一蒸馏水漂洗3次一晾干一紫外线照射30min（或先用75%酒精浸泡、擦拭，再用紫外线照射30min）。凡能耐热的塑料

11、器皿，最好经101.3kPa（121.程）高压灭菌。（3）胶塞等橡胶类处理新购置者先经自来水冲洗一2%NaOH煮沸15min-自来水冲洗一2%5%HCl煮沸15min-自来水冲洗5次以上一蒸馏水冲洗5次以上一蒸馏水煮沸10min，倒掉沸水让余热烘干瓶塞等。或蒸馏水冲洗晾干，整齐摆放于小型金属盒内经101.3kPa高压灭菌。（4）金属器械的清洗新购进的金属器械常涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最后用酒精棉球擦拭，晾干。用过的金属器械应先以清水煮沸消毒，再擦拭干净。使用前以蒸馏水煮沸10min，或包装好以101.3kPa高压15min。（5）除菌滤器的处理用过的滤器将滤膜去除，

12、用三蒸水充分洗净残余液体，置干燥箱中烘干备用。2包装包装的目的是防止消毒灭菌后再次遭受污染，所以经清洗烤干或晾干的器材，应严格包装后再行消毒灭菌处理。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。包装分为局部包装和全包装两类，前者用于较大瓶皿，一般用硫酸纸和牛皮纸将瓶口包扎好；后者适于较小培养瓶皿、吸管、注射器、金属器械和胶塞等，以下为常用瓶皿、吸管、无菌衣帽等的包装方法，其它物品可参照处理瓶类：硫酸纸罩以瓶，外罩二层牛皮纸用绳扎紧。小瓶皿、胶塞、刀剪等器械可装人饭盒，饭盒再以牛皮纸包好，绳扎好。吸管、滴管用脱脂棉塞上不要太紧或太松）装人消毒筒内，滤器、滤瓶、橡

13、皮管等都要用牛皮纸包好瓶口等，外罩一层牛皮纸包好，再用包布包好。无菌衣、帽、罩，均以牛皮纸或包布包好，绳扎好。3消毒灭菌严格的消毒灭菌对保证细胞培养的成功是极为重要的，其方法分为物理法和化学法两类。前者包括干热、湿热、滤过、紫外线及射线等，后者主要指使用化学消毒剂等。热灭菌：玻璃器皿，160170C，90120min或180C4560min。蒸气灭菌：用于玻璃器皿、滤器橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等，不同物品其有效灭菌压力和时间不同，如培养用液、橡胶制品、塑料器皿等用68kPa（115C）高压灭菌1Omin;布类、玻璃制品、金属器械等用103kPa（121.r）高压灭菌15

14、20mino滤过除菌：适于含有不耐热成分的培养基和试剂的除菌，用孔径为0.22例微孔滤膜可除去细菌和霉菌等，用此滤膜过滤两次，可使支原体达到某种程度的去除，但不能除去病毒。紫外线：紫外线的波长为200300nm，最强是在254nm，615平方米最少一只紫外灯，高度要在2.5m以下，湿度45%60%，杆菌效果好，球菌次之，霉菌、酵母菌最差，实验前应不低于30分钟的照射时间。熏蒸消毒：当遇有细胞培养出现多次污染，或实验室两个月一次的常规消毒，均可用高锰酸钾57.5g加甲醛（40%）1015ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭24h，至少4h以上。煮沸消毒：紧密情况时使用

15、，金属器械和胶蹇在水中煮2030分钟，趁热倾去水分即可使用。化学消毒：化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制进行消毒灭菌的方法。实验室桌面、用具及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒杀菌。常用的有：2%煤酚皂溶液（来苏尔）、0.25%新洁尔灭、1%升汞、35%甲醛溶液、75%酒精。【实验报告】玻璃器皿的清洗步骤和要领是什么？【思考题】消毒除菌的方式有哪些？各适用于什么物品或场所的消毒除菌？实验2细胞培养液的配制【实验目的】熟练掌握培养基（DMEM）的配制，了解其它培养基的配制方法。【实验原理】组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的

16、需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其它辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、贴附因子等，这是合成培养基无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清（10%）。【仪器、材料和试剂】仪器：蠕动泵1套，滤器1套，蒸馏器，高压蒸汽灭菌锅，磁力搅拌器，pH计。材料：500mL、250mL盐水瓶，250mL或500mL培养液瓶，0.22m的微孔滤膜。3试剂：双蒸水，小牛血清，合成培养基（DMEM），NaHCO3【操作步骤】过滤器的准备

17、和安装清洗好过滤器，干燥，放入一张0.22m的微孔滤膜，用布包装好，15磅20min进行高压蒸汽灭菌处理。在超净工作台内安装好过滤装置，准备过滤。合成培养基的配制将干粉型培养基溶于总量1/3的三蒸水中，再用1/3水冲洗包装内面两次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。搅拌使其溶解。将干粉溶于450毫升水中，充分搅拌使其溶解，用水冲洗包装内面，确保干粉都溶解成培养液根据产品说明的要求和实验补加3.7gNaHCO3。加抗生素：最终浓度青霉素为100U/ml，链霉素100“g/ml。一般市售青霉素为80万U/瓶，将其溶解在4ml体积内，每1000ml培养液中加0.5ml，即成最终浓度为100

18、U/ml。市售链霉素为100万U/瓶，将其溶解5ml体积内，也是每1000ml加0.5ml，使其最终浓度为100“g/ml。调节培养液的pH值为7.27.41000毫升容量瓶定容。过滤法除菌。分装于玻璃瓶中，4C冰箱保存备用。使用时加血清。小牛血清的处理市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体。将血清放入56C水浴中30min,其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。4生长培养基的配制除无清培养之外，各种合成培养基在使用前需要加入一定量的小牛血清（约10%）。【注意事项】1培养液配好后，要先抽取少许放入培养瓶内在37C温箱内置2448h,

19、以检测培养液是否有污染。然后再用于实验。2配制培养液所需血清的质量要合格并保持稳定。一个批号试用效果良好后，就可一次购入较多同一批号的血清，这样实验条件稳定，配液时调整pH值较易。3每次配液量以使用两周左右的量为宜。一次配液不要太多，一是营养成分有损失，二是容易污染。【实验报告】列出详细细验操作过程，并在每步操作之后标明该步骤常发生的问题，如何解决这些问题及该步骤应注意的事项。【思考题】1为什么进行细胞培养时培养液中需要加入一定量的小牛血清？2如何确认你所配制的培养基没有被细菌污染？实验3细胞传代培养与细胞生长曲线的绘制（MTT法）【实验原理】细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞

20、能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，为培养细胞生物学特性的基本参数之一。典型的细胞生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡四个阶段。以存活细胞数对培养时间作图即生长曲线。生长曲线一般有两种测定方法：计数法和MTT比色法间接测量。生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。MTT比色法的基本原理是：MTT（溴化噻唑蓝四唑）

21、被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原后，生成不溶于水的蓝色的甲臜（Formazan颗粒，甲臜被助溶剂溶解后，可在酶标仪上读取其光吸收值（0D）。因为线粒体脱氢酶的含量与细胞的数目成正相关，所以蓝色颗粒的多少可以代表细胞的相对数量。又由于死细胞中的琥珀酸脱氢酶失去活力，MTT并不能被其还原。所以通过在酶标仪上测定0D值，就可以反映出活细胞的相对数量。【实验目的】掌握细胞传代培养的方法掌握每代细胞的生长过程及生长特点，掌握细胞生长曲线的绘制方法。掌握体外培养细胞的常规检查内容及方法。掌握无菌操作技术，熟练各实验器材的使用。【器仪、材料及试剂】1仪器：倒置显微镜，二氧化碳培养箱、超净工作台等。2材料：

22、人宫颈癌细胞株HeLa、细胞培养瓶、96孔板、针孔滤器、注射器、滴管（吹打管）移液枪、细胞计数板等。3.试剂：0.2眺胰蛋白酶、DMEM培养液（含胎牛血清FBS）、5mg/mlMTT、0.玖台盼蓝、双抗（青霉素+链霉素）、DMSO【操作步骤】细胞传代：取70%-80%汇合的培养细胞，使培养瓶的细胞面向上，倒去原瓶内培养液。2向培养瓶内加入0.2玖胰蛋白酶ImL，轻轻振动培养瓶，使细胞面与胰蛋白酶接触5s,即倒掉胰蛋白酶。再加入胰蛋白酶ImL，将培养瓶置于倒置显微镜下观察，当观察到大部分细胞出现胞质回缩、细胞间隙增大、细胞变圆现象时，立即将培养瓶直立，终止消化。3去除消化液，加入培养液2mL，用

23、吹打管吸取培养液吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞（注意：整个细胞面都要吹打到，包括边角细胞）。吹打勿用力过猛，以免伤害细胞。4将细胞悬液分成两份，一份（ImL）接种到新的培养瓶中，补齐培养液至3mL，用于传代。一份用于细胞生长曲线的绘制。细胞生长曲线的绘制：1取上述细胞悬液（ImL）滴，滴到细胞计数板上，进行计数。根据所计数结果将原液稀释成4X104个/mL。2将细胞接种到96孔板中，100uL/孔，最后每孔再加100uL培养液，补齐至200uL。（注意：接种时要将细胞悬液吹打均匀，每隔段时间要吹打次，以防细胞聚集沉底，保证每孔加入的细胞总数致）3接种后，每24h取3个孔加入无菌的MTT液，10

24、uL孔（操作时避光）4.4h后，将孔内的溶液全部吸出，加入DMSO，100uL/孔，混匀，将孔内溶液移到新96孔板中，于酶标仪检测570nm处的光吸收值（0D值）。5以培养时间为横坐标，0D值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。【注意事项】传代培养时要注意严格的无菌操作，并防止细胞之间的交叉污染。酶解消化过程中要不断观察，消化过度会对细胞造成损害，消化不够则难于将细胞解离下来。传代后每天观察细胞生长情况，包括培养液颜色变化，细胞形态改变，是否污染，细胞是否健康生长：健康细胞的形态饱满，折光性好。掌握好传代时机：健康生长的细胞生长致密，7080铺满瓶底时，即可传代5做MTT细胞生长曲线时，接种细胞的数量

25、要准确，否则后面的工作无法进行。实验报告】1试述传代培养的步骤和注意事项，并以文字描述细胞传代后细胞每天的生长情况。2绘制细胞生长曲线。【思考题】1细胞传代培养的目的是什么？2判断细胞健康的标准是什么？3贴壁细胞和悬浮细胞在传代方法上有什么不同？4MTT法从根本上是反映细胞的代谢和增殖活力，而非细胞数量。为什么？实验4原代细胞培养乳鼠组织块法原代培养【实验原理】直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养称为原代细胞培养。原代培养是建立各种细胞系的第一步，是从事培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。根据培养方法不同分为组织块培养法和单层细胞培养法（消化培养法）。原代培养是获取细胞的主要手段，但原

26、代培养的组织由多种细胞成分组成，比较复杂，因而原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需对细胞进行纯化。【实验目的】掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培养过程中的无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的观察方法。【仪器、材料及试剂】1仪器：培养箱、培养瓶、培养皿、弯头吸管、移液管、手术器械材料：新生1一3天的乳鼠试剂：DMEM培养基，Hank液，酒精。【操作步骤】组织块直接培养法将新生大鼠引颈处死，置75%酒精泡23S（时间不能过长、以免酒精从和肛门浸入体内）再在超净台内将新生小鼠解剖，取肝脏，置平皿中。用Hank液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。用手术剪将肝

27、脏剪成小块（1mm2），再用Hank液洗三次。将组织块用眼科镊送入培养瓶內，用弯头吸管将组织块在瓶壁上均匀摆置，每小块间距0.5cm左右。25mL的培养瓶以2030块为宜。组织块放好后，翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块，置37C培养箱静置35h,轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37C继续培养。组织块培养3一5d后进行换液。【注意事项】1自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。2在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。3操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼后应该待其冷却才能夹取组织。4操作动作要准确敏捷，但又不能太

28、快，以防空气流动，增加污染机会。5待组织块略干燥能黏贴附于瓶壁时再使之与培养基接触，勿使组织块漂浮起来。如果组织块没有贴壁，则细胞不易生长，即使生长也因没有贴在瓶壁上面而无法收集到。附胰酶消化法同组织块法前三步。视组织块量加入510倍的0.25%胰酶液，37C水浴中消化2040min每隔5min振荡一次，使细胞分离。待组织变得疏松，颜色略为发白时，加入35ml培养液（含10%小牛血清）以终止胰蛋白酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。1000rpm，离心10min弃上清液。消化后将细胞悬液通过100目孔径不锈钢网滤过，以除掉未充分消化的大组织。加入Hank液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。加入培养液l2ml（视细胞量），血球计数板计数。将细胞调整到5X105个/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37C下培养。上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。【实验报告】记录实验过程和细胞生长情况【思考题】1.细胞培养中如何防止污染？2组织块培养3一5d后进行换液的目的是什么？比较组织块培养法和消化培养法获得原代培养物的效果和各自的优缺点。实验5细胞冻存实验原理】细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196C液氮中低温保存，以使细胞暂时脱离生长状态