白花丹醌对人急性早幼粒细胞白血病细胞的体外效应

1、白花丹醌对人急性早幼粒细胞白血病细胞的体外效应【摘要】根据作者已往的临床经历，中草药白花丹对急性早幼粒细胞白血病APL治疗有效，但至今尚无关于白花丹对APL疗效方面的系统研究。本研究的目的是通过NB4细胞体外观察白花丹提取物白花丹醌plubagin对细胞增殖及凋亡的影响。采用TT比色法检测白花丹醌对NB4细胞增殖抑制作用；用光学显微镜及透射电镜观察细胞形态改变；DNA凝胶电泳及annexinV/PI双染实验测定检测细胞凋亡；DNAPI染色法检测细胞亚二倍体峰及细胞周期。结果显示:白花丹醌在2-15l/L浓度范围内可以显著抑制NB4细胞的增殖，且呈剂量依赖性效应关系P0.01；在光学显微镜及透射

2、电镜下可见典型的细胞凋亡形态变化；白花丹醌诱导细胞出现DNA梯形条带，annexinV/PI-凋亡细胞及亚二倍体峰，细胞周期阻滞于G2/期，凋亡细胞比例与白花丹醌呈剂量依赖性效应关系(P0.05)。结论：本研究首次证实白花丹醌可以抑制APL细胞系NB4的增殖、诱导细胞凋亡及阻滞细胞周期进程。【关键词】白花丹醌EffetsfPlubaginntheHuanAutePryelytiLeukeiaellsInVitrAbstratArdingtpreviuslinialexperienesftheauthrs，plubagzeylaniaaseffetiveagainstautepryelytile

3、ukeia(APL).Hever，itseffetivenesshasneverbeenprvenexperientallyrunequivallylinially.Thisstudyasaiedtinvestigatetheeffetsfplubaginntheprliferatin，ellyleandapptsisfAPLelllineNB4ells.ellinhibitryrateseredetetedbyTTlrietriassay；rphlgihangeserebservedunderlightirspeandtransissineletrnirspe;apptsis-induing

4、effetseredeterinedbyDNAgeleletrphresis，annexinV/PIduble-stainedandPIsingle-stainedflytetry.Theresultsdenstratedthat2-15l/LplubagininhibitedtheprliferatinfNB4ellsinadse-dependentanner.Therphlgihangesfellapptsis，suhashrsendensatinandappttibdyfratin，erebservedbylightirspeandtransissineletrnirspe.ellyle

5、analysisshedthatNB4ellsereblkedinG2/phasefellyle.AndplubagininduedannexinV/PI-ellinreaseandDNAfragentatin.Thereasarrelatinbeteenellapptsisratesandthenentratinsfplubaginindse-dependentanner(P0.05).Itisnludedthatfrthefirsttiethepresentstudyshsthatplubaginaninhibitellprliferatin，blkellyleandindueapptsi

6、sfAPLelllineNB4ells.Keyrdsplubagin;autepryelytileukeia;NB4ell;apptsis白花丹是一种生长在我国四川、福建、台湾、广西、广东等地区的常见植物，容易采获。白花丹具有祛风散瘀、解毒杀虫、消肿止痛等作用，用于血瘀经闭、跌打损伤、痈肿疮毒等。白花丹醌plubagin是白花丹的主要活性成分，具有广泛的药理活性，包括抗菌消炎、抗生殖、抗凝等作用1-3。研究说明，白花丹醌可以抑制P388淋巴细胞白血并宫颈癌、肝癌等多种肿瘤细胞，是一种很有潜力的抗肿瘤药物3-6。根据作者已往的临床经历，中草药白花丹对人急性早幼粒细胞白血病APL治疗有效。但迄今为

7、止尚无关于白花丹提取物白花丹醌对APL疗效的研究报道。本研究旨在以NB4细胞为体外模型，初步讨论白花丹提取物白花丹醌对APL细胞的增殖、细胞周期及凋亡的影响。材料和方法主要药物及试剂白花丹醌plubagin，Lt：023K0760为美国Siga公司产品，溶解于二甲亚砜(DS)中，配成0.1l/L储藏溶液，置于-4保存，使用时应用RPI1640培养液稀释至工作浓度工作液中DS终浓度均小于0.1，预实验证实对NB4细胞无影响。胎牛血清为TBD产品，annexinV/PI试剂盒购自北京宝赛生物技术。细胞系及细胞培养人APL细胞系NB4细胞为本所长期保存，培养于含10%胎牛血清、100U/l青霉素、1

8、00g/l链霉素的RPI1640培养液中，置37、5%2、饱和湿度的培养箱中培养，3-4天传代1次，取对数生长期细胞进展实验，台盼蓝染色拒染率均在95以上。NB4细胞增殖的检测取对数生长期细胞进展实验，以5104/l浓度将NB4细胞接种于96孔培养板star，每孔180l，置37、5%2培养箱中培养24小时后进展实验。设不同浓度组、细胞对照组和空白对照组，每组设4-6个平行孔，继续培养24小时或48小时，实验终止前参加TT5g/l工作液，37孵育4小时，离心弃上清。参加100l10SDS-0.01NHl，避光过夜，酶标仪570n测吸光度A值。实验重复3次，计算细胞生长抑制率，其公式为：生长抑制

9、率=(1-实验组A值/对照组A值)100%。NB4细胞形态观察白花丹醌作用NB4细胞24小时后于倒置显微镜下日本lypusIT-2观察培养瓶内细胞形态。另外，收获1107个细胞，PBS洗2次，2.5%戊二醛固定液4下固定2小时以上，1锇酸4下固定2小时，梯度丙酮脱水，浸透，包埋，超薄切片后，铀及铅双重染色，透射电镜日本电子100X-下观察细胞超微构造变化并摄像。凋亡细胞的DNA片段凝胶电泳收获各组培养细胞，用常规盐析法提取基因组DNA，2琼脂糖电泳，紫外线光下观察并记录结果。细胞凋亡的annexinV-FIT/PI双标记流式细胞术F检测按照说明书操作，离心搜集106个细胞，用PBS洗2遍，将细

10、胞重悬于200lbingdingbuffer中，参加annexin-FIT中混匀，避光4反响30分钟，参加PI5l，避光4反响5分钟，参加300lbingdingbuffer，立即上流式细胞仪FASan型，美国BetnDikinsn公司检测。实验重复4次取均值。细胞DNA含量的DNAPI染色F测定将搜集的NB4细胞在预冷的75%乙醇中固定，-20过夜，PBS缓冲液洗去固定液，RNaseA消化，PI染色，F检测，用随机所附的elldifit软件分析细胞周期。低于G1期的细胞(亚二倍体)为凋亡细胞，其占细胞总数的比例为凋亡细胞率。统计分析数据以均数标准差(xSD)表示，采用SPSS10.0软件包处

11、理，P0.05为有显著性差异。结果白花丹醌对NB4细胞的增殖抑制作用TT检测显示，白花丹醌在2-15l/L浓度范围内对NB4细胞均有增殖抑制作用，随着白花丹醌浓度的增加，NB4细胞活力下降，与对照组相比，差异具有显著性P0.01表1。白花丹醌作用24小时的I50约为9l/L，48小时的I50约为5l/L。Table1.EffetsfplubaginnNB4ellprliferatin(略)白花丹醌诱导NB4细胞凋亡倒置显微镜观察对照组细胞那么明显聚集成簇，局部贴壁。白花丹醌作用后的NB4细胞数量减少，细胞大小不均，折光性减弱，细胞核固缩，细胞变分散。透射电镜(TE)观察局部细胞细胞器生物膜皱褶

12、起泡，胞浆中出现空泡，细胞体积缩小，细胞器致密化，核染色质浓缩边集形成新月体，细胞膜及核膜相对完好；还有局部细胞核碎裂及凋亡小体形成(图1)。凋亡细胞的DNA琼脂糖电泳NB4细胞在浓度为5、10、15l/L的白花丹醌作用24小时后，在DNA琼脂糖电泳显示明晰的DNA梯形条带图2。Annexin/PI染色检测结果白花丹醌作用NB4细胞后annexinV+PI+及annexinV+PI-细胞均增多(图3)，说明白花丹醌细胞凋亡的作用，随着白花丹醌浓度的增加，NB4细胞早期凋亡率递增P0.05(表2)。Table2.Effetfplubaginnapptsisrates(%)fNB4ellsdete

13、rinedbyannexinV/PIstaining(略)白花丹醌诱导NB4细胞G2/期阻滞白花丹醌作用24小时后，NB4细胞出现亚二倍体细胞，且凋亡细胞比例与白花丹醌浓度呈剂量依赖关系P0.05；同时白花丹醌作用后G2/期细胞增多，提示白花丹醌可以影响细胞周期进程，使细胞阻滞于G2/期表3，图4。Table3.Effetfplubaginnthedistributinsfellyleandsub-G1phase(略)讨论白花丹醌是白花丹科植物白花丹PlubagzeylaniaLinn全草及枯燥根的主要有效成分1-3。白花丹醌是一种小分子萘醌化合物，为棕黄色结晶，熔点为76-78，溶于乙醇、氯

14、仿，微溶于沸水。其分子式为11H83，相对分子量为188.18，化学构造式是5-羟基-2-甲基-1，4萘醌5-hydrxy-2-ethyl-1，4-naphthquinne。研究发现，白花丹醌具有抗肿瘤、抗炎、抗细菌、抗真菌等多种作用1，2，5。白花丹醌在体外对多种肿瘤细胞系有增殖抑制作用，体内试验也有抗肿瘤作用4-6。恶性肿瘤的发生和细胞增殖与凋亡平衡失调有关7，细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用，可以遏制肿瘤迅速生长，人们在肿瘤治疗的长期理论中，逐渐认识到可以通过诱导肿瘤细胞凋亡到达治疗肿瘤的目的。本研究通过形态学检测、膜联蛋白染色、DNA凝胶电泳及亚二倍体检测证实，白花丹醌可诱导NB4

15、细胞凋亡，且凋亡细胞比例与白花丹醌浓度呈依赖关系。Srinivas6等研究结果说明，白花丹醌可诱导宫颈癌细胞凋亡，其作用机制与白花丹醌增加通过胞内的活性氧物质RS含量，激活aspase-3、-9，促进凋亡诱导因子AIF释放有关。白花丹醌诱导APL细胞凋亡的作用机制尚待进一步研究证实。细胞周期是维持细胞正常分裂增殖的重要环节，假如细胞周期的某个环节受阻，细胞生长就会受到抑制。我们的研究发现白花丹醌作用后的NB4细胞后G2/期细胞增多，这提示白花丹醌具有调控G2/期调控点的才能。Jaisal等8在小鼠胚胎纤维母细胞的研究中发现，白花丹醌通过诱导周期蛋白依赖蛋白激酶抑制剂DKIp21的产生，调节细胞

16、周期阻滞于S-G2/期。本研究结果显示，白花丹醌体外可抑制细胞增殖，调控细胞周期进程及诱导细胞凋亡，有望成为APL新的辅助治疗方法。本实验仅讨论了白花丹提取物白花丹醌在体外对人APL细胞系NB4细胞的影响，其在体内对细胞的影响尚有待进一步研究。【参考文献】1郭晓庄.有毒中草药大辞典.天津：天津科技翻译出版公司.1992：177-1792?全国中草药汇编?编写组.全国中草药汇编.北京:人民卫生出版社.1975：2883LinL，YangLL，huJ.yttxinaphthquinnesandplubagiaidglusidesfrPlubagzeylania.Phytheistry，2022;6

17、2:619-6224赵铁建，钟振国，方卓等.白花丹水煎液对小鼠四氯化碳肝损害的影响.广西中医学院学报，2022;7:43-455Krishnasay，PurushthaanKK.Plubagin:astudyfitsantianer，antibaterialandantifungalprperties.IndianJExpBil，1980;18:876-8776SrinivasP，GpinathG，BanerjiA，etal.Plubagininduesreativexygenspeies，hihediateapptsisinhuanervialanerells.laring，2022;40:201-2117DeviPU，RaBS，SlnFE.Effetfplubaginntheradiatininduedytgenetiandell