完结2018文献精读春季班肿瘤-蛋白修饰zl5

1、ENSIVEREADINGSUMO(E1)SUMOSUMO(E2) SUMO(E3) SUMO(SENP)SUMOSUMO概念：是一种类泛素蛋白，它通过与底物蛋白共价连接来调节靶蛋白的定位以及靶蛋白与其他生物大分子的相互作用。 SUMO小蛋白的分子质量约11 kDa,虽与泛素在氨基酸序列上只有18%的相似性，但在二三级结构上却高度相似，且蛋白水解后 的C末端双甘氨酸模 置相似。哺乳动物体内存在5种不同SUMO蛋白：SUMO1/2/3在各种组织均有表达；SUMO4主要在肾脏、淋和脾脏中表达；SUMO5在肺与脾脏中表达。SUMO化E1活化酶异二聚体 SAE1 SAE2E2结合酶仅有一个Ubc9E3

2、连接酶种类繁多，主要分为三大类 PIAS去SUMO化去SUMO化酶 Ulp SENPsRanBP2 Pc21SUMO化和去SUMO化过程：【1】SUMO前体在SUMO特异性蛋白酶(SENP)下切除C端数个氨基酸，从而出双甘氨酸残基，成为成SUMO，【2】随后，在ATP-Mg 2+ 存在的条件下，SUMO蛋白C末端Uba2/Sae1所组成的E1活化酶腺苷酸化，出的双甘氨酸模体被【3】导致SUMO被转移至E2结合酶Ubc9的半胱氨酸而等待与底物连接。【4】连接过程可不依赖E3连接酶，通过直接识别底物的SUMO结合保守序(KXE)与之结合，但主要还是经E3连接酶介导与底物连接。【5】最后，由去SUM

3、O化酶Ulp或SENPs将SUMO从底物移除，产生的游离SUMO进入另一循环过程。1SUMO化在细胞生长中的功能细胞周期转录因子细胞应激细胞凋亡信号通路11MYC募集P-TEFb促进转录延伸2010, Cell, c-MYC regulates transcriptional pause release机制探究1寻找相关性机制探究2a: WBb: IFPIAS1PIAS1ser2ser2FlavpiridolCDK9c:PIAS1/SUMO-1CDK9SUMOCDK9 CDK7 CDK12 BRD4ser2a: CDK9/SUMO/PIAS1 b: HA-PIAS1 F-CDK9 c: F-U

4、BC9 Myc-CDK9d:293T,293T293TCDK9SUMOSUMOe: 293Tf: 293Tser2 g: HeLaCDK9, 42kDaUBC9, 42kDa CDK9SUMOCDK9SUMOCDK9HCT116e-g:CDK9C-20 from Santa CruzFig2:CDK9 SUMOpol IIser23h:i:Wp1/2MEFCDK9UBC9, MycSUMOCDK9;SUMOMyc-CDK9 HeLa42kDa CDK9CDK9j:PIAS1/SUMO-1Myc-CDK9SUMOCDK9 K/RCDK9 29KRCDK9 K/RFig2:3a: 293T3a:

5、BrU b: HeLac:PIAS1 MORT-qPCRSUMO;PIARNAMO;PIAFig4: SUMO3d: BrUb: HeLac:HeLaUBC9UBC9RNA;UBC9RT-qPCRg: 和野生型相比，Senp1-/- MEFs整体转录水平更低h:RT-qPCRSenp-/- MEFsFig4: SUMO3a: RNA-seq分析证明过表达PIAS1或PIAS1/SUMO-1降低了总体表达水平；b: 进一步分析发现过表达PIAS1或PIAS1/SUMO-1表达下调的分别15453和17662个；c: SUMO更倾向抑制高度活跃表达的；d: 挑选几个典型进行RT-qPCR验证。Fi

6、g5: SUMO3e: pol II ChIP-seq实验证明过表达PIAS1/SUMO-1, pol II在转录起启位置分布增多，在gene body分布减少；e: pol II ser2P ChIP-seq实验证明过表达PIAS1/SUMO-1, pol II ser2在转录起启位置和gene body分布都减少；g: flag ChIP-seq数据分析发现flag-PIAS1在转录起启位置有少量富集。Fig5: SUMO3h: RNA-seq分析证明敲除UBC9促进了总体表达水平；i: 统计一下受敲除UBC9影响表达变化的个数；j: 敲除UBC9更倾向促进高度活跃表达的表达；k: 挑选几

7、个典型进行RT-qPCR验证;l: 过表达PIAS1/SUMO-1表达下调的和敲除UBC9表达上升的，二者有4477个重合。Fig5: SUMO3a: WB验证构建的两个细胞株可用；b: 外源表达PIAS1/SUMO-1抑制CDK9KO/Myc-CDK9细胞内ser2磷酸化，但CDK9KO/Myc-CDK9K/R细胞不受影响；c: 在CDK9KO/Myc-CDK9细胞表达PIAS1/SUMO-1抑制活性P-TEFb的形成以及体外对CTD的磷酸化，反之CDK9KO/Myc-CDK9K/R细胞却不成立。Fig6: SUMOCDK9 SUMO3d: CDK9KO/Myc-CDK9细胞表达PIAS1/

8、SUMO-1抑制总体转录水细胞却不成立；之CDK9KO/Myc-CDK9K/Re: 挑几个RT-qPCR验证。Fig6: SUMOCDK9 SUMO3f: 免疫荧光表明CDK9KO/Myc-CDK9细胞表达PIAS1/SUMO-1抑制ser2磷酸化化，反之CDK9KO/Myc-CDK9K/R细胞却不成立；e: BrU染色实验表明CDK9KO/Myc-CDK9细胞表达PIAS1/SUMO-1染色信号弱，反之CDK9KO/Myc- CDK9K/R细胞却不成立；a: HeLa外源表达MYC促进全局性转录；b: WB检测外源表达MYC促进ser2磷酸化以及抑制内源CDK9 SUMO化； c: BrU染

9、色实验证明表达MYC，BrU染色信号增强；d: IF验证表达MYC ser2染色信号增强，ser5没有变化。e: WB检测HeLa细胞外源表达MYC抑制外源CDK9 SUMO化，而MYC会受到SUMO化；f: IF检测外源表达MYC抑制外源表达PIAS1或PIAS1/SUMO-1引起的ser2染色信号降弱。g: HeLa细胞敲除MYC ser2磷酸化降低，内源CDK9 SUMO化增强； h: 293T细胞敲除MYC ser2磷酸化降低，内源CDK9 SUMO化增强； i: T细胞激活促进MYC表达，ser2磷酸化增加，CDK9 SUMO化降低；j: T细胞激活整体转录水平增强。a: WB检测在KO/CDK9细胞过表达MYC促进ser2磷酸化，但在KO/CDK9K/R细胞不成立；b: IF验证在KO/CDK9细胞过表达MYC ser2染色信号增强，但在KO/CDK9K/R细胞不成立；Fig8: MYCCDK9 SUMO3c: 在KO/CDK9细胞表达MYC促进转录(total RNA增多)，但在KO/CDK9K/R细胞不成立；d: BrU染色实验证明在KO/CDK9细胞表达MYC染色信号增强，但在KO/CDK9K/R细胞不成立;e: 挑几个进行RT-qPCR验证。f: