毛细管电泳精品课件

1、毛细管电泳第1页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四3.10.1 概述1. 电泳：在外加电场的影响下，带电的胶体粒子或离子在介质中作定向移动的现象称为电泳。2.不同带电粒子的电荷量和分子大小不同，流动速率也不同，因此电泳是一种适用于胶体粒子和离子的分析分离技术。第2页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免

2、疫学等领域得到了广泛应用。第3页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四原则上按电泳的原理来分，可分为二类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 电泳的分类第4页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作为支持介质

3、，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。第5页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分

4、蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质第6页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、 板电泳、柱电泳。 据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量、免疫电泳。第7页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四电泳技术的特点凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析;样品用量极少;设备简单;可在常温进行;操作简便省时;分辨率高;特别适合于蛋白、核酸等大分子物质的分离。是生化药物、基因工

5、程药物分析的重要手段。第8页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四毛细管电泳（CE）毛细管电泳（CE）又称高效毛细管电泳（HPCE）或毛细管电分离法（CESM），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液体分离分析技术。毛细管电泳实际上包括电泳、色谱及其交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入到纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析称为可能。第9页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四高效毛细管电泳（HPCE）高效毛细管电泳（HPCE）是近年来发展起来的一种高效、快速的分离分析技术，是经典电泳技术

6、和现代微柱分离相结合的产物。HPCE已成为一种重要的分离分析方法，在生物、医药、化工、环保、食品等领域具有广阔的应用前景。第10页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四3.10.2 高效毛细管电泳的理论基础1.经典电泳与高效毛细管电泳区别（1） 经典电泳分离法的不足所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。（2） 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了0.05mm内径的毛细管,； 二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电

7、压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。第11页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四2.电泳现象与电渗流现象电泳：在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移的现象称为电泳。电渗流（electro osmotic flow，EOF）：指管内溶液在外力电场作用下整体向一个方向运动的现象。第12页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四HPCE通常采用的是石英毛细管柱，一般情况下（pH3），硅醇基（SiOH）电离为硅氧基负离子（S

8、iO），使管壁表面带负电，为了保持电荷平衡，溶液中水合离子（一般为阳离子）被吸附到表面附近，形成双电层。当在毛细管两端加高电压时，双电层中的阳离子向阴极移动，由于离子是溶剂化的，所以带动了毛细管中溶液整体向阴极移动，产生电渗流。在不少情况下，电渗流的速度是电泳流速度的57倍。第13页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四3. 分离过程 电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反，电渗流 电泳

9、时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。第14页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四正离子的运动方向和电渗流一致，因此最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，其移动速度相当于电渗流速度；而负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，因而各种粒子因差速迁移而分离。分离方式的优点：所有正负离子和中性分子都向同一个方向迁移，因此可在柱末端放置检测器实现在线检测。第15页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四4. 分离方程粒子的

10、电泳速率由下式决定：其中E为电场强度，ep为两溶质的平均电泳淌度，即离子在给定介质中单位时间和单位场强下移动的距离，淌度的大小与粒子的净电荷、半径及介质黏度等相关。第16页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四溶液中同时存在泳流和渗流，在不考虑相互作用的前提下，粒子在毛细管内电解质中的运动速度应当是电泳流速度（ ）和电渗流速度（ ）的矢量和，即 式中，eo为电渗淌度，V为外加电压，L为毛细管总长度。第17页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四理论塔板数n为：式中D为扩散系数，分离度R为1，2分别为相邻两溶质的电泳淌度，ep为两溶质的平均电泳淌度。第18页，

11、共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四在HPCE中电渗流的一个重要特点是具有平面流型，电渗的驱动力沿毛细管均匀分布，它使整个流体象一个塞子一样以均匀的速度向前运动。而在HPLC中流体流型则是抛物线型的层流，其中心处速度是平均速度的2倍。电渗流的平面流型和HPLC中高压泵驱动所产生的抛物线型层流的速度曲线不同，不会直接引起样品组分区带在柱内扩张，这是HPCE获得高效分离的重要原因之一。第19页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四5. HPCE的特点优点：1. 高灵敏度：采用电化学检测器，最低检测限可达10-19 mol；2. 高效：HPCE每米理论塔板数为几十

12、万，高者可达几百万甚至几千万；3. 高速：通常的分析时间不超过30 min。有1.7 min内分离19种阳离子及3 min内分离30种阴离子的报道；4. 样品用量少：只需nL（109 L）级；5. 低消耗：每次分析只需少量（几毫升）流动相，分析过程是在价格低廉的毛细管柱中进行；6. 应用范围广：从简单的无机离子、有机离子到整个细胞，都可进行分离分析。具有“万能”分析功能或潜力。不足之处：进样不够方便。应用范围相对较窄。分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。第20页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四6. 影响柱效的

13、因素及改进方法热效应：焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。电渗流控制：电渗流的大小和方向依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂。则可以改变电渗流的方向。第21页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四3.10.3 高效毛细管电泳仪器 电压：030KV。 分离柱不涂敷任何固定液， 紫外或激光诱导荧光检测器（可检测到：10-1910-21 mol/L）第

14、22页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四毛细管的特点第23页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四检测器由于HPCE采用了极小内径的毛细管，进样量很小，因此只有具有高灵敏度的检测器，才能进行定性、定量分析。检测器是HPCE仪的关键部件。HPCE检测器中应用较广泛的是紫外-可见检测器和电化学检测器。迄今为止，除了原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱（ICP）及红外光谱未用于HPCE外，荧光、电化学、质谱、激光类和其他类型检测器（如折射率检测器、同位素检测器等）均已应用。第24页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四3.10.4 高效毛细

15、管电泳的分离模式1. 毛细管区带电泳(CZE)2. 毛细管凝胶电泳(CZE)3. 胶束电动毛细管色谱（MECC或MEKC）4. 毛细管等电聚焦(CIEF)5. 毛细管等速电泳（CITP）6. 毛细管电渗色谱第25页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四1. 毛细管区带电泳capillary zone electrophoresis ，CZE 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反；电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不

16、但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。 最基本、应用广的分离模式；第26页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四2. 毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis ，CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺

17、。柱便宜、易制备。第27页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四 1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。3. 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 在电场力的作用下，胶束在柱中移动。第28页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四 2. 电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动； 5.色谱与电泳分离模式的结合。 3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组

18、分与胶束结合的较牢，流出时间长； 4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；第29页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四 1. 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术； 2. 毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度； 3. 氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；4. 毛细管等电聚焦 capillary isoelectric focusing，CIEF第30页，共

19、44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四 4. 聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离； 5. 阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液； 6. 加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测； 7. 电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。第31页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四 1. 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。 2. 负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试

20、样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。5. 毛细管等速电泳 capillary isotachophoresis ，CITP第32页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四 3. 不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E)，淌度大的离子区带电场强度小； 沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4 电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队； 4. 特点：界面明显，富集、浓缩作用；capillary isotacho

21、phoresis ，CITP第33页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四(1)在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程.(2)这种方式将HPLC发展的固定相引入到CE中，增加了选择性，但又保持了CE的固有优点，是一种有发展前景的分离模式。6. 毛细管电渗色谱 capillary electroosmostic chromatography ，CEC第34页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四3.10.5 应用与进展1. 离子分析2. 药物分析3. 手性化合物分析4. 氨基酸与蛋白质分析5

22、. 核酸分析及DNA排序6. 新进展第35页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四1. 离子分析 analysis of ion阳离子分析 迁移方向和电渗流方向一致； 4.5min内分离了24种金属离子； 阳极进样，阴极检测； 具有很高的灵敏度；第36页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四阴离子分析 阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低； 质量小、电荷密度大的离子如：SO4-2、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测； 加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；离子价态及存在形态分析；第37页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四2. 药物分析 analysis of pharmaceutics 检测体液或细胞中某些代谢产物的分析； 尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段； 采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；第38页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLG法第39页，共44页，2022年，5月20日，23点50分，星期四3.手性化合物分析 analysis of chiral comp