固定化酶讲稿

1、关于固定化酶第一张，PPT共六十页，创作于2022年6月2问题：酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使用，而且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。办法：将水溶性酶或游离细胞经过化学或物理手段处理，将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子在此空间进行活跃的催化作用，成为不溶于水的固定化酶或细胞。 固定化酶:固定在载体上，并在一定范围内进行催化反应的酶。一、固定化酶发展简史第二张，PPT共六十页，创作于2022年6月3一、固定化酶发展简史第三张，PPT共六十页，创作于2022年6月4 1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。 1960年，日本的千

2、畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究，开始了将固定化酶在工业上应用的第一步。 1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学拆分，实现了酶连续反应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。 1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。一、固定化酶发展简史第四张，PPT共六十页，创作于2022年6月5二、固定化酶的制备 (一) 吸附法（二）包埋法（三）共价结合（偶联）法（四）交联法（五）固定化酶制备方法小结（六）固定化方法与载体的选择第五张，PPT共六十页，创作于2022年6月6Methods of immobilization二、固定

3、化酶的制备第六张，PPT共六十页，创作于2022年6月7(一) 吸附法 吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。 只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶，是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。二、固定化酶的制备第七张，PPT共六十页，创作于2022年6月8 根据吸附剂的特点又分为两种：物理吸附法和离子结合法。 物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。 常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微孔玻璃等无机吸附剂和纤维素、胶原、火棉胶等有机吸

4、附剂。二、固定化酶的制备第八张，PPT共六十页，创作于2022年6月9 离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用固定化酶的方法（离子键）。 最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。 离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。二、固定化酶的制备第九张，PPT共六十页，创作于2022年6月101.影响酶蛋白在载体上吸附的因素: pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。 离子强度：多方面的影响，一般认为盐

5、阻止吸附。 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。 温度：蛋白质往往是随温度上升而吸附减少。 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。 蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。 二、固定化酶的制备第十张，PPT共六十页，创作于2022年6月11 优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到固定化和纯化的目的，所得到的固定化酶使用中失活后可以重新活化和再生。 缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落，会导致催化活性的丧失和沾污反应产物。 世界第一例获得工业应用的固定化酶是DEAE-Sephad

6、ex A-25吸附的氨基酰化酶，反应用于DL-AA的光学拆分。2.吸附法的优缺点二、固定化酶的制备第十一张，PPT共六十页，创作于2022年6月12（二） 包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。二、固定化酶的制备第十二张，PPT共六十页，创作于2022年6月13 将酶分子包埋在高聚物网格内的方法。 聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 ： 先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，在酶分子周围形成交联的高聚物网络。 它的机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时可能使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。 1、凝胶

7、包埋法（胶格包埋法）：二、固定化酶的制备第十三张，PPT共六十页，创作于2022年6月14 海藻酸钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化，操作简单经济。 -角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化酶的活性回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。 胶原和明胶也是常用的包埋载体。二、固定化酶的制备第十四张，PPT共六十页，创作于2022年6月152、微囊化包埋法微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业使用 。微囊制备方法（1）界面沉淀法是一种简单的物理微囊

8、化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成膜，将酶包埋。（2）界面聚合法是将亲水性单体和疏水性单体利用界面聚合的原理包埋酶的方法。所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。（3）表面活性剂乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。 二、固定化酶的制备第十五张，PPT共六十页，创作于2022年6月16二、固定化酶的制备第十六张，PPT共六十页，创作于2022年6月17 优点：在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。 缺点：是只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物

9、是大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。3.包埋法的优缺点二、固定化酶的制备第十七张，PPT共六十页，创作于2022年6月18（三） 共价结合（偶联）法 是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上（借助共价键将酶的非活性必需基团和载体的功能基团进行偶连）。二、固定化酶的制备第十八张，PPT共六十页，创作于2022年6月191.共价偶联法中的影响因素 （1）载体的物化性质：要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功

10、能基团。 （2）偶联反应的反应条件：必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。 （3）偶联反应的选择：要尽量考虑到酶的其它功能基团发生的副反应尽可能少。 （4）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。二、固定化酶的制备第十九张，PPT共六十页，创作于2022年6月20 优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用。 缺点：载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。2.共价偶联法的优缺点二、固定化酶的制备第二十张，PPT共六十页，创作于2022年6月21 （四

11、） 交联法 共价交联法的基本原理是酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三维的交联网状结构。二、固定化酶的制备第二十一张，PPT共六十页，创作于2022年6月22交联法是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。能起交联作用的试剂很多，但目前常用的交联试剂是戊二醛和双耦联苯胺-2,2-二磺酸。交联法常与吸附法结合使用，或者与包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合于载体上。二、固定化酶的制备第二十二张，PPT共六十页，创作于2022年6月23 1.共价交联法的三种形式（1）酶直接交联法 在酶液中加入适量多功能试

12、剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH、离子强度、温度和反应时间之间的平衡。 操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。二、固定化酶的制备第二十三张，PPT共六十页，创作于2022年6月24（2）酶辅助蛋白交联二、固定化酶的制备 可以使用“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共价交联的方法。 这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。第二十四张，PPT共六十页，创作于2022年6月25（3）吸附交联法 此法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联，用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化

13、酶。二、固定化酶的制备第二十五张，PPT共六十页，创作于2022年6月26酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联二、固定化酶的制备第二十六张，PPT共六十页，创作于2022年6月27二、固定化酶的制备第二十七张，PPT共六十页，创作于2022年6月28（五）四种固定化酶制备方法特点小结物理吸附包埋法共价结合法共价交联法制备易易难难结合力弱强强强酶活力高高中中底物专一性无变化无变化有变化有变化再生可能不可能不可能不可能固定化费用低中高中制法特性二、固定化酶的制备第二十八张，PPT共六十页，创作于2022年6月291.必须注意维持酶的催化活性和专一性2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度4.

14、固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应6.固定化酶要廉价（六）固定化方法与载体的选择二、固定化酶的制备第二十九张，PPT共六十页，创作于2022年6月30 有一定的机械强度且稳定性好，催化剂与系统分相。 固定化酶在使用前可充分洗涤，不带进杂质，在反应中酶与产物自然分开，所以产物易提纯，收率也高。 酶与细胞经过固定化以后，稳定性大为提高，可较长期使用与储藏，并可再生。 能反复使用，可大大降低生产成本；同时也为实现生产的管道化、连续化与自动化提供了可能。三、固定化酶的性质第三十张，PPT共六十页，创作于2022年6月31三、固定化酶的性质第三十一张，PPT共六十页，创作

15、于2022年6月32（一） 影响固定化酶性质的因素 酶经过固定化后引起的性质改变，不外乎两种原因：一是酶本身的变化，二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。就载体物化性质和固定化过程影响而言，主要存在以下三种影响效应： 分配效应 空间障碍效应 扩散限制效应三、固定化酶的性质第三十二张，PPT共六十页，创作于2022年6月33 1、分配效应 由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。 三、固定化酶的性质第三十三张，PPT共六十页，创作于2

16、022年6月34 2、空间障碍效应 固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易与底物或效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。三、固定化酶的性质第三十四张，PPT共六十页，创作于2022年6月35三、固定化酶的性质第三十五张，PPT共六十页，创作于2022年6月36 3、扩散限制效应 酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，产生扩散阻力： 1） 外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前

17、，发生在固定化颗粒周围的液膜层。 它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。三、固定化酶的性质第三十六张，PPT共六十页，创作于2022年6月37 2） 内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。 载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的主要原因。因此使用低分子量底物，小的载体粒径、载体孔尽可能大、直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。三、固定化酶的性质第三十七张，PPT共六十页，创作于2022年6月38（二） 固定化酶性质的改变 1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降

18、，其专一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因： 酶分子在固定化过程中，酶的空间构象发生了变化， 甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。 固定化后的空间障碍效应的影响。 内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻。 包埋法时被高分子物质半透膜包围。三、固定化酶的性质第三十八张，PPT共六十页，创作于2022年6月39 2、固定化后酶稳定性提高 稳定性提高的原因： 固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子 伸展变形。 酶活力的缓慢释放。反应开始只有部分酶起作 用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起 作用。 抑制自降解，提高了酶稳定性。三、固定化酶的性质第三十九张，PPT共六十页，创作于202

19、2年6月40 3、固定化酶的作用pH变化（载体及产物） 酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。 一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。三、固定化酶的性质第四十张，PPT共六十页，创作于2022年6月41 4、固定化酶的最适温度的变化 酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的结果。三、固定化酶的性质第四十一张，PPT共六十页，创作于2022年6月42 5、米氏常数Km的变化 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能

20、变化。 由于酶高级结构变化及载体影响，引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。 这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至消失。三、固定化酶的性质第四十二张，PPT共六十页，创作于2022年6月43 （三） 固定化酶的活力 固定化酶的活力即是固定化酶催化某一特定化学反应的能力。其大小可以用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。 它的单位可定义为每毫克干重固定化酶每分钟转化底物的量：用mol/minmg。 1） 活力测定方法分为： 间歇测定：在搅拌或振荡反应器中，在与溶液酶同样测定条件下进行，然后间隔一定时间取样，过滤后按常

21、规进行测定。 连续测定：固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液，根据流速和反应速度之间关系，算出酶活力。三、固定化酶的性质第四十三张，PPT共六十页，创作于2022年6月44 活力回收= 100% 3） 固定化酶的半衰期 在连续测定的条件下，固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间称为固定化酶的半衰期。以t1/2表示。 固定化酶的操作稳定性是影响使用的关键因素，半衰期是衡量稳定性的指标。 2） 固定化酶的活力回收 三、固定化酶的性质第四十四张，PPT共六十页，创作于2022年6月45四、固定化酶的应用GoGoGoGo3.在分析化学中的应用 1.在工、农

22、业生产上的应用2.在医药、治疗上的应用第四十五张，PPT共六十页，创作于2022年6月461、固定化酶在工农业生产上的应用 产 物 酶或细胞 固定化方法 原 料L-氨基酸果糖浆6-APAL-门冬氨酸L-苹果酸低乳糖牛奶乳糖干蛋白果汁脱苦啤酒植物白脱脂肪酸氨基酰化酶葡萄糖异构酶或含该酶之菌体青霉素酰胺酶含有门冬氨酸的菌体含有反丁烯二酸酶的菌体乳糖酶碱性蛋白酶葡萄糖氧化酶和氧化氢酶柚苷酶木瓜蛋白酶脂肪酶脂肪酶载体结合法载体结合法或交联法载体结合法胶格包埋法胶格包埋法载体结合法载体结合法胶格包埋法载体结合法载体结合法或包埋法胶格包埋法载体结合法乙酰-DL-氨基酸葡萄糖青霉素G反丁烯二酸反丁烯二酸牛奶

23、牛奶蛋白桔类果汁生啤酒植物油植物油四、固定化酶的应用第四十六张，PPT共六十页，创作于2022年6月47实例：A.葡萄糖异构酶 世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。四、固定化酶的应用第四十七张，PPT共六十页，创作于2022年6月48泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala B. 氨基酰化酶（Aminoacylase） 世界上第一种工业化生产的固定化酶四、固定化酶的应用第四十八张，PPT共六十页，创作于2022年6月49溶液酶的应用缺陷：酶作为异体物质，在体内应用会导致免疫反应；酶是蛋白质，在体内易被网状内皮

24、系统移除和被蛋白质酶水解破坏；由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适浓度 2、固定化酶在医药治疗上的应用四、固定化酶的应用第四十九张，PPT共六十页，创作于2022年6月50 （1）转入体内发挥作用（口服和注入） 口服：最初主要限于消化酶类，近年来也有人尝试将酶以口服方式用于尿中毒等疾患的治疗。口服的优点是药物通过粘膜吸收后能迅速进行扩散，进入体内，通常不会引起免疫反应。注入：是最有实用价值的一种方式，溶液酶的弱点集中于此方式。 固定化酶可很好的地解决这一问题，办法是将药物酶包埋于半透膜中，可防止药物酶和蛋白水解酶以及其它免疫因子等直接接触，因而可延长酶在体内的半衰期和避

25、免免疫过敏反应。四、固定化酶的应用第五十张，PPT共六十页，创作于2022年6月51（2）通过“体外循环”做成人工脏器 固定化酶也可做成“人工脏器”参与体外循环。有两方面应用：用于除去有害的毒性物质及有潜在毒害作用的代谢产物；除去氨基酸，使需要这些物质的病变组织“饿死”；治疗时只需将患者的血液引出体外，通过由固定化酶等构成的“人工脏器”加以处理，然后再回流体内。四、固定化酶的应用第五十一张，PPT共六十页，创作于2022年6月52实例： A. 消血栓：纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。 用包埋法制备的固定化酶可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。四、固定化酶的应用第五十二张，PPT共六十页，创作于2022年6月53B.人工肾 将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用微胶囊固定化脲酶和活性炭组成人工肾