抗过敏益生菌唾液乳杆菌PM-A0006调节过敏体质抗过敏

1、J.Agric.FoodChem.2007,55,11080-11086Heat-KilledCellsofLactobacilliSkewtheImmuneResponseTowardTHelper1PolarizationinMouseSplenocytesandDendriticCell-TreatedTCells论：热杀死抗过敏乳酸菌唾液乳杆菌PM-A0006调节过敏体质抗过敏乳酸菌为人类及哺乳类肠胃道中的共生菌之一，已被认定为益生菌，对于维持宿主健康扮演着重要的角色，包括了其对于免疫功能的调节。目前大部分的研究皆比较着重于乳酸菌的活菌体(viablecell)对于免疫调节作用的影响，

2、而本实验则主要是在于乳酸菌热杀死菌体的影响。我们藉由将三株热杀死乳酸菌L.acidophilusA2、L.gasseriA5和L.salivariusA6与脾脏细胞共同培养，来探讨此三株热杀死乳酸杆菌对于免疫功能所产生的影响。另一方面，我们亦将三株热杀死乳酸菌刺激树突细胞后，以观察T细胞的免疫反应。由实验结果显示三株热杀死乳酸菌证实能刺激小鼠的脾脏细胞增生和interleukin(IL)-10、IL-12p70和interferon(IFN)-y之分泌，但对transforminggrowthfactor(TGF)-3无影响。另外，三株热杀死乳酸菌亦能刺激小鼠的树突细胞分泌高量的IL-12p7

3、0，且由提高IFN-y分泌，非IL-5、IL-13及TGI-p之结果显示，T细胞的免疫反应趋向Th1。以上结果显示乳酸杆菌(lactobacilli)对于调节免疫机能及过敏反应扮演了重要的角色。KEYWORDS:Lactobacillus;splenocytes;dendriticcells;Thelper1;cytokines益生菌被定义为“活菌，能在固有的营养条件下，增进健康”(1)。乳酸杆菌是人和哺乳动物胃肠道的共生微生物的成员之一，通常被认定为益生菌(2,3)。肠道乳酸菌一般被认为对于宿主的免疫反应之调节，扮演着一个重要的角色(1,4-6)。乳酸菌具有影响肠周边免疫系统的功能(5,7)

4、。在肠道中，乳酸细菌细胞壁的组成成分在刺激免疫活性的细胞扮演一个重要的角色(4,5,8,9)。位于肠中的乳酸菌，包括各种乳酸杆菌，可交互调控肠中的一些细胞，包括抗原呈现细胞(APCs)以及小肠上皮细胞(intestinalepithelialcells)(10-12)。近期的一些报告中也指出，乳酸菌可能可调控免疫路径Th1与Th2之间的平衡，有助于减轻过敏反应1(5,13-15)。一般认为是靠一些特殊的免疫细胞产生的细胞激素，例如:IL-10和TGF-p，来保持这样的平衡(16,仃)。而大部份的研究主要针对活的乳酸菌在免疫调节上之影响，而本篇研究则是研究经热杀死的乳酸菌。其拥有保存期限长、贮存

5、方便、便于运输等优点。图一：热杀死乳酸杆菌对小鼠脾脏细胞增生之影响。柱状图分别代表脾脏细胞对不同热杀死乳酸菌、PHA或无刺激物之结果，其中后两项为实验对照组。数据资料计算结果为平均数土标准差(个数=3，pv0.05)由骨髓中衍生的树状细胞(Dendriticcells,DC)，是引发适应性免疫对抗外来病源的专一性抗原呈现细胞(18)。未成熟的树状细胞藉由血液的流动进入非淋巴组织里，例如皮肤和黏膜，来捕捉和呈现抗原。然后移到淋巴腺器官，例如淋巴结、脾脏和黏膜伴生的淋巴组织(mucosal-associatedlymphoidtissues,MALT)，其中他们失去抗原加工活性并且成熟为强有力的免

6、疫刺激细胞(18,19)。在肠黏膜中之树状细胞可能由乳酸菌调控，包括肠中原有的共生菌和经由口服(administeredorally)入内的(20)。他们在Peyer氏斑间接通过M细胞(21)，与乳酸菌交互作用，且绕过紧连的上皮中进入小肠内腔直接与乳酸菌作用(22)。而树状细胞藉由这些微生物的刺激而变成熟，包括上游调节共激分子(costimulatorymolecule)以及cytokines和chemokines的分泌，以及提供各种T细胞的免疫反应。举例来说，树状细胞上游调节了共激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)及产生IL-12，造成Th1路径反应(23)。他们也生产IL-4和

7、IL-10，促进Th2路径或Treg反应(24-26)。以人类及老鼠的试验中显示，乳酸菌能有效的刺激产生IL-12以及IFN-Y，并且调整免疫反应(13,14,27)，它能调控树状细胞表面的分子表现和cytokine的分泌(28-30)。口服和原本在肠道中的乳酸杆菌，是十分相近于肠黏膜中之树突细胞，藉此产生Th1、Th2和Treg路径的免疫调控。在本文中将探讨三种经热杀的乳酸菌在小鼠脾脏细胞增生以及cytokine产生的现象做探讨。同时我们也对于T细胞的影响做探讨。材料与方法乳酸杆菌的处理：本研究所使用的三种乳酸杆菌由位于台南科学园区,东宇生物技术股份有限公司所提供，分别为经由热杀死的Lact

8、obacillusacidophilusPM-A0002(A2),LactobacillusgasseriPM-A0005(A5),以及LactobacillussalivariusPM-A0006(A6)。在热处理之前，分别以MRS培养基，379培养16小时，经离心(2000g10min)后，使用去离子水洗涤两次悬浮于phosphate-bufferedsaline(PBS;0.85%NaCI,2.68mMKCI,10mMNa2HPO4,and1.76mMKH2PO4atpH7.7溶液中，之后以1009煮沸15分钟杀死。DC的备制：小鼠DC来源是由国家实验室动物中心(台北，台湾)购买的6至1

9、0星期成熟母鼠(BALB/c)骨髓中取得，经PBS洗涤两次后，将细胞数以RPMI-1640(含10%FBS、GM-CSF及IL-4)调整成1*106cell/mL，放入24-well培养皿中培养6日，期间23日更换一次培养基。脾脏细胞和T细胞的备制：来源是使用BALB/c母鼠，采断颈法牺牲后,在无菌环境取出脾脏，加入Ficoll-Hypaque后以400g，离心30分钟。位于低密度的部分，约42.550%的介面，从其中分离出单一细胞悬浮于PBS中取出脾脏，加入Ficoll-Hypaque后以400g，离心30分钟。位于低密度的部分，约42.550%的介面，从其中分离出单一细胞悬浮于PBS中。C

10、D4+T细胞的纯化采用MiltenyiBiotec.,Auburn,CA所制造的极性抗体和毫米磁珠系统纯化收集，之后将纯化的小鼠CD4+T细胞培养在含有10%FBS的RPMI-1640培养基中，调整细胞数量成2*106cell/mL放入96-well培养皿中。-4-C2-RLIA)乳酸杆菌刺激脾脏细胞：将细胞调整成4*105cell/mL后，跟热杀死的乳酸菌以1:3的比例，于379高湿度、5%CO2的环境下共同培养24、48、72小时和5日。以1pg/mLPHA当作对照组。经24、48、72小时的培养后，取上层液利用ELISA分析IL-10,IL-12p70,IFN-Y，andTGF-p的分泌

11、量；而培养5日后，则使用MTT来分析脾脏细胞的增殖情况。乳酸杆菌刺激树状细胞：将细胞调整成1*106cell/mL后，跟热杀死的乳酸菌以1:10的比例，于379高湿度5%CO2的环境下共同培养24、48、72小时。以0.1pg/mLLPS当作对照组。经24、48、72小时的培养后，取上清液，以ELISA分析IL-4、IL-10及IL-12p70之分泌量。并以抗生素(mitomycinC,25pg/mL),379处理1小时，让DC停止生长。图四：经由热杀死乳酸杆菌处理DC,对T细胞增生的影响。柱状图分别代表，树状细胞以热杀死处理之乳酸菌、LPS或无刺激时，与T细胞共培养24、48、72小时的结果

12、。数据资料计算结果为平均数土标准差（个数=3,p0.05）。A-C分别代表不同的经不同物质刺激后，所得到的数据在统计上是否归类为同一种类的表现；而X与丫分别代表不同的时间点，所得到的数据在统计上是否归类为同一种类的表现。经乳酸杆菌所处理后的DC来刺激T细胞：停止增生的DC与T细胞以1:10的比例，于379高湿度5%CO2的环境下共同培养2和5日。收集培养2日的细胞上层液，利用ELISA分析IL-5、IL-13、IFN-丫以及TGF-B之分泌量；而培养5日的细胞，则使用MTT来分析T细胞的增殖情况。统计分析：数据所代表的是平均数土标准差（mean土SD），样本数为3（n=3），统计的比较是藉由D

13、uncansmultiple-rangetest之变异数来分析，p值少于0.05被认为统计上有差异性。结果：乳酸杆菌促进脾脏细胞的增生：三种经过热杀死的乳酸菌，包括L.acidophilusA2,L.gasseriA5,和L.salivariusA6，被测试用来引发脾脏细胞的增生能力（图一），PHA（1pg/mL）为此试验的正对照组。结果显示相对于负对照组，L.salivariusA6有效地诱导脾脏细胞之增生（约增加了11倍）。诱导脾脏细胞来促进细胞激素的产生：为了确定这些热杀死的乳酸菌是否增进脾脏细胞分泌细胞激素，因此分析了脾脏细胞与热杀死乳酸菌共培养24、48、72小时之后，上层液所含IL

14、-10、IL-12p70、IFN-丫、TGF-B的量（图二）。以PHA（1pg/mL）当作正对照组。结果显示三种菌都能诱导IL-10的分泌（图二A）;但是远低于IL-12p70的量（图二B）。三种菌均对小鼠的脾脏细胞产生很强的刺激，分泌大量的IL-12p70，而在图2C显示，只有L.salivarius对于产生IFN-丫较显着（图三C）。L.acidophilus的试验组在24小时的培养下，能测得较高的IFN-y生成量；L.gasseri和L.salivarius则以48小时的培养下得到较高。然而与负对照组的比较中发现，此三种热杀死乳酸菌对脾脏细胞产生TGF-B则没有明显的作用（图二D）。促进

15、树状细胞产生细胞激素：为了确定这些热杀死的乳酸菌是否增进树状细胞分泌细胞激素，因此分析了树状细胞与热杀死乳酸菌共培养24、48、72小时后，上层液所含IL-4、IL-10、IL-12p70的量（图三）。以LPS当作正对照组。结果显示，培养48小时的条件下，任合一组所测试出的IL-4量均低于负对照组（图三A）但在24和72小时均未侦测到（pv0.05）。而IL-10的变化，在三个时间点观察下，各组差异均不大（图三B）湘对的，IL-12p70则都有极高的表现量（图三C）。菌处理的树状细胞刺激T细胞增殖为了测试成熟的DC是否可活化T细胞，DCs先经这些热杀死的乳酸菌刺激后，再与T细胞共同培养5天。结

16、果显示（图四），在共同培养24小时的条件下，T细胞的数量的确增加许多（增加约23倍）。在48小时或72小时后的观察下发现，除了经由L.gasseri处理的试验组外，其余均比负对照组高出约1.5倍。CZ3-理沽总口菌处理的树状细胞诱导T细胞分泌细胞激素：进一步确定T细胞所分泌细胞激素的种类，我们收取培养2日后的上层液，分析IL-5、IL-13、IFN-Y以及TGF-p的生成量（图五）。结果发现IL-5的量没有明显的改变（图五A），而IL-13的量也远低于负对照组（图五B）。然而，经过乳酸杆菌刺激后的DC与T细胞共同培养，却可刺激T细胞产生IFN-y（图五C），当T细胞以L.acidophilus

17、或L.salivarius处理的树状细胞刺激24小时及L.gasseri处理的树状细胞刺激48小时下，有高量的IFN-y被产生。至于TGF-p，除了L.gasseri的组别在24小时观察下，量略低以外，其余组别之间在统计上无明显差异（图五D）。LJt-UCii兀Bp讨论：包含新型抗过敏乳酸菌菌株组合物(康敏元益生菌)，目前已知道对于健康有很多益处，例如：免疫调节，改善过敏体质。多数研究集中于探讨抗过敏乳酸菌或其细胞壁萃取物对于免疫的调节作用；然而，本篇在于探讨热杀死乳酸菌的研究。过敏反应是由于Th1/Th2间之平衡被破坏使反应趋向Th2免疫反应，巨噬细胞(Macrophage)的IL-12，与

18、T细胞衍生的IFN-丫为Th1路径下所产生的cytokines，它可以增进细胞免疫反应的调节。IL-12刺激T和NK细胞产生IFN-y，并且促进未成熟CD4+T细胞进入Th1的分化路径(32,33)。IFN-y亦增加IL-12的产生，并减低Th2路径细胞的增殖与活化，提高体液免疫能力(34)。IL-10和TGF-p为免疫抑制的cytokines，能抑制作用T细胞(effectorTcell)的活性与能力，例如Th1和Th2细胞。他们在Treg细胞族群的分化和作用也扮演一个重要角色(16,17)。本研究结果显示，根据IFN-y在脾脏细胞的产生结果，L.salivarius可以促进小鼠脾脏细胞的大

19、幅度增生，但是L.acidophilus和L.gasseri只有小幅度增加。然而，三种乳酸杆菌刺激脾脏细胞所得到的结果显示，均产生高量IL-12p70;但IL-10的表现量相对较低，TGF-B甚至侦测不到表现，这样显示乳酸菌强烈刺激脾细胞偏向Th1的路径反应(35)。利用L.caseiShirota也能刺激脾脏细胞产生IL-12和IFN-y(27)。也有报告指出，定时摄取乳酸杆菌可以增加鼠类脾脏细胞产生IFN-y，但对于IL-4或是IL-5则没有影响(36,37)。所以肠道中的乳酸菌可以透过肠中的DC来调节免疫功能。DC如果产生IL-12，则造成Th1反应(23),同样的如果产生IL-4和IL

20、-10，则促进Th2或Treg反应(24-26)。由Th2细胞所分泌的IL-5和IL-13来恢复粒状效应细胞，例如嗜酸性、硷性及柱状细胞(mastcell)在过敏发炎部位的作用(38,39)。在这项研究中，三种热杀死乳酸菌能引起小鼠DC分泌IL-12p70，但是IL-10及IL-4则较无影响。以乳酸菌处理的树状细胞有促进T细胞的增殖，及增加IFN-y的表现量，此代表成熟的DC经乳酸杆菌的刺激，将T细胞免疫反应趋向Th1路径。Mohamadzadeh等人指出(29),L.johnsonii,L.reuteri,和L.gasseri可刺激人类单核球树状细胞(monocytederivedDCs)产

21、生IL-12，而非IL-10，显示将免疫路径导向Th1。但有文献指出L.casei与L.plantarumLb1刺激小鼠DC强烈引起IL-12的生成；而L.reuteriDSM12246却是引起IL-10的生成(28)。近来也有报导指出L.acidophilus与L.paracasei能强烈刺激人类单核球树状细胞产生IL-12(30)。所以到底是么机制造成各种乳酸杆菌在树状细胞上产生不同的反应，目前仍未知，但在免疫调节的反应上造成的差异，可以推断于几个原因，例如使用的不同的乳酸细菌和人或老鼠免疫细胞。根据早先观察和我们的结果，推断乳酸菌所诱导产生之细胞激素与乳酸菌菌种有关。本研究发现，经热杀死

22、的乳酸杆菌在体外试验中有免疫调控能力。在大鼠身上，经热杀死处理之L.plantarumL-137会诱导IL-12和IFN-y的产生，并抑制因IL-4之诱导而生成的IgE，进而压抑Th2免疫反应(40)。而且，使用热杀死的L.caseiShirota经由体外试验刺激脾脏细胞或口服，均能诱导IL-12和IFN-y及Th1路径的细胞激素产生(27,41)。从本试验可得知，经热杀死的乳酸菌对于免疫调节也具有功效，并非活菌才能引发免疫反应。总之，研究所使用的三种热杀死的乳酸菌，包括L.acidophilusA2,L.gasseriA5,L.salivariusA6，能活化老鼠脾脏细胞和DC，驱使T细胞往

23、Th1免疫反应。从此结果可得知，经热杀死的特定乳酸菌菌株可运用在免疫调节上并扮演着重要的角色。经热杀死的乳酸菌有着长产品贮藏期限、更容易保存和运输等优点。便于出外旅游携带，也许可以扮演免疫预防的目的。LITERATURECITEDGuarner,F.;Schaafsma,G.J.Probiotics.Int.J.FoodMicrobiol.1998,39,237-238.Molin,G.;Jeppsson,B.;Johansson,M.L.;Ahrne,S.;Nobaek,S.;Stahl,M.;Bengmark,S.NumericaltaxonomyofLactobacillusspp.as

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