转基因大米中科丰6号和克螟稻的检测研究

1、转基因大米中科丰6号和克螟稻的检测研究转基因大米中科丰6号和克螟稻的检测研究由于转基因作物种植面积的不断扩展，转基因作物不但广泛进入食品市场，而且已成为饲料行业的主要原料来源1。然而，基因工程掌握的不确定性及不可预测性，使得转基因食品平安问题成为目前人类在开展过程中必须面对的一个棘手的环境问题2。各国政府纷纷出台了一系列有关转基因及其产品的管理、规定和法规，要求对转基因及其产品进展标注，标明其是否为转基因，让消费者选择3。2002年我国农业部公布的?农业转基因生物标识管理方法?，规定对5大类17种产品必须进展标识4。1材料和方法1.1仪器高速冷冻离心机3K18型，德国Siga公司；超纯水处理器

2、illi-Qplus，法国产；梯度PR仪yylerT，美国Bi-RAD公司；电泳仪PERPa300，美国Bi-RAD公司；凝胶电泳图像分析系统2000型，美国Bi-RAD公司；恒温摇床，rbitalshaker，TherFra，美国产；7500Fast实时荧光定量PR仪，美国ABI公司。1.2材料和试剂TAB提取缓冲液20g/LTAB，1.4l/LNal，0.1l/LTris，20l/LNaR2REDTA，pH8.0；TAB沉淀缓冲液5g/LTAB，0.04l/LNal；TE缓冲液：Tris0.01l/L，Na2EDTA0.001l/L，用Hl或NaH调节pH至8.0；稀释液：aters-DE

3、Ptreated，上海生工；蛋白酶K：20g/L；Nal溶液，1.2l/L；无水乙醇、氯仿、异丙醇等有机试剂；荧光定量PR试剂盒：TaKaRaPreixExTaq2；样品来源：本实验室检测留样。待测式样见表1，由中国检验检疫科学研究院提供。1.3引物根据国内外文献查阅的KF6科丰6号和KD克螟稻的引物信息7-8，见表2。1.4检测步骤1取一定重量的检验样品，详细重量按照相关标准执行7-19，放到枯燥干净的研磨器中充分研磨约10分钟，样品呈粉末状为佳。*研磨器不能连续运行超过1分钟，中间需暂停，取出转子摇匀样品，再研磨。2取大约1g研磨好呈粉末状的其他样品参加到15l离心管中，做好标记，另取约1

4、g阴性样品作为提取对照。*取样尽量取最细的。1在制备好的样品中参加5LTAB提取缓冲液可加20L蛋白酶K溶液，水浴65孵化1h检查样品材料是否膨胀，样品应只有悬浮在液体中，如材料膨胀，再参加TAB提取缓冲液，每次1L。2孵育过夜。3常温离心12000rp，10in直至悬浮部分几近清澈注意不能使用冷冻，因为冷冻使部分DNA沉淀。4将1L的上清液转入2L的离心管中，参加700L氯仿，高速涡旋震荡混合30s。5常温12000rp，10in，搜集600-650L上清，转移到一个新的2L离心管，参加2倍体积的TAB沉淀缓冲液。6室温2024孵化60in，12000rp离心10in。弃上清，将沉淀溶于35

5、0L，1.2l/LNal溶液。参加350L氯仿，高速涡旋震荡30s，混匀。712000rp离心15in，小心将上清转移至新的反响管中，参加0.8倍体积的异丙醇，室温2024孵化至少20in。812000rp离心10in，弃上清。参加500L，70%乙醇洗涤沉淀，小心高速涡旋震荡约30s，12000rp离心10in。9弃上清，使沉淀枯燥。最好室温条件下过夜；或60以下15in20in，不能让沉淀过干。10将DNA溶于100LTE缓冲液中，4保存备用。1阴性对照、阳性对照和空白对照的设置。阴性对照以待测非转基因食品的DNA为模板。阳性对照以采用含有待测基因序列的植物的DNA为模板，或采用含有待测基

6、因序列的质粒。空白对照分别设DNA提取空白对照以水或TE代替样品和PR反响的空白对照以水或TE代替DNA模板。2PR反响体系。PR反响体系见表3。每个DNA样品至少做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全参加反响液中，不要粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。3仪器设置。设定样品名称、报告基团和猝灭基团的种类、荧光信号搜集等。4PR反响参数。UNG酶消除残留污染：120s，50活化DNA合成酶/预变性：600s，95PR45个循环变性：15s，95退火/延伸/荧光信号搜集：60s，60。5PR反响运行。按预先设定的样品摆放顺序将PR反响管依次摆放上机前注意检查各反响管是否盖紧，以免荧光物质泄漏

7、污染仪器，开始运行仪器进展实时荧光PR反响。实时荧光PR反响完毕后，设置荧光信号阈值，阈值设定原那么根据仪器噪声情况进展调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。空白对照：内源基因和外源基因均无荧光增幅现象。阴性对照：内源基因有荧光增幅现象且t值小于或等于36，外源基因无荧光增幅现象。阳性对照：内源基因和外源基因均有荧光增幅现象，且t值小于或等于36。测试样品外源基因检测t值等于40，判断该样品不含所检的外源基因。测试样品外源基因t值小于或等于36，判断该样品含有所检的外源基因。测试样品外源基因检测t值在3640之间，应调整模板浓度，重做实时荧光PR。再次扩增后的外源基因检测t值

8、仍小于40，那么可断定为该样品检出基因。再次扩增后的外源基因检测t值等于40，那么可断定为该样品未检出基因。1.5特异性试验样品A1、D、E、A2重复提取3次DNA，将DNA样品配制成10-20ng/uL浓度，取5uL用作PR模板进展扩增。每个PR反响2个平行。1.6灵敏度试验提取样品B1、1、B2、2的DNA，将DNA样品配制成20ng/uL浓度，取5uL用作PR模板进展扩增，每个PR反响20个平行。1.7PR扩增效率将提供的含量1%转基因大米KF6的DNA，连续4倍梯度稀释，配制成浓度分别为20ng/uL，5ng/uL，1.25ng/uL，0.31ng/uL，0.08ng/uL的转基因基因

9、组DNA溶液，分别记为R1、R2、R3、R4和R5，作为标准品进展PR扩增。分别取5uLDNA用作PR模板进展扩增，根据模板DNA浓度和扩增的t值绘制标准曲线。每个PR反响3个平行。2结果与分析2.1特异性试验结果不同样品PR扩增的结果见表4。样品A中内标基因、构造特异基因和KF6品系特异基因为阳性，其余为阴性；样品D中内标基因为阳性，其余为阴性；样品E中内标基因为阳性，其余为阴性；样品F中内标基因、构造特异基因和K品系特异基因为阳性，其余为阴性。以上结果说明，本工程的检测方法对于KF6和K成分的检测也具有良好的特异性。2.2灵敏度试验结果对不同含量的B1、1、B2、2样品的DNA模板进展扩增

10、的结果见表5，每个PR反响20个平行，结果显示：B样品的内标基因、构造特异基因和品系特异基因20个平行均为阳性；样品的内标基因、构造特异基因和品系特异基因20个平行均为阳性，说明该检测方法用于水稻及其产品转基因成分的检测灵敏度可到达0.01%，且具有良好的重复性。2.3PR扩增结果PR反响效率及结果记录见表6。3结语所有的转基因植物新品系必须通过平安性评价及田间试验才能被获准商业化消费。然而不可防止的有未获准商业化消费的品系混进市场，或者由于田间试验时造成污染而得以繁殖。目前所检测的转基因植物包括了官方批准的和未经官方批准的品系，而无论是何种品系，检测方法只能在转基因新品系被发现并且序列被公布后才能建立起来，并且对于未经官方批准的转基因品系，阳性样品较难获得，这也限制了很多实验室对其检测方法的研究。目前国内尚无任何一个品系的转基因大米被获准商业化消费，检验检疫系统中虽然有相关的行业标准，但标准方法只能对BT品系进展挑选，并不能特异性检出转基因水稻科丰6号和克螟稻品系，本课题研究的检测体系针