牛膝中对成骨样细胞UMR106有促进增殖作用的活性成分研究

1、牛膝中对成骨样细胞UMR106有促进增殖作用的活性身分研究【摘要】目的探求牛膝中对成骨样细胞UR106的增殖有明显促进作用的活性身分。要领运用薄层、色谱技能等要领举行分散，断定。效果分散出3个化合物，结晶-谷甾醇、结晶胡萝卜苷、结晶蜕皮甾酮。结论牛膝的醋酸乙酯层用硅胶柱色谱、薄层色谱、反相高效液相色谱平分散本领举行化学分散，得到3种含量较大的化合物。【关键词】牛膝高效液相色谱-谷甾醇胡萝卜苷蜕皮甾酮牛膝为苋科牛膝AhyrenthesbidentataBI的枯燥根，主产于河南省，也称怀牛膝，具补肝肾，强筋骨的成效。主治腰膝酸痛，下肢萎软。药理学研究表白：牛膝具有保肝、落酶、镇痛、抗炎、加强免疫力

2、及抗朽迈作用。其化学身分重要为多糖，齐墩果酸类三萜皂苷和植物甾酮类。按照中医理论，对30种中药提取物举行活性挑选，创造牛膝的甲醇提取物对破骨细胞具有较强按捺作用。进一步研究证明：牛膝正丁醇可溶部门为其活性身分。为了探求牛膝中明显促进骨样细胞UR106增殖的活性身分，对牛膝的甲醇提取物的正丁醇可溶部门的化学身分举行研究，分散得到3个化合物。1质料与要领1.1仪器、试剂及药品JJasPU-980高效液相色谱输液泵日天职光公司，JasUV-975紫外-可见检测器(日天职光公司)；Khr色谱事情站SientifiSysteIn.，X-250超声波洗濯器北京医疗装备二厂，1H-NRBrukerARX-3

3、00300Hz核磁共振仪。乙腈色谱纯，天津四友生物医学技能提供；硅胶，青岛海洋化学试剂厂提供。牛膝购自辽宁省沈阳市中药材公司，经本校药用植物教研室孙启时传授断定为AhyranthesbidentataBI之枯燥根比较品-谷甾醇、胡萝卜苷、蜕皮甾酮比较品由本校自然药化研究室李铣传授提供纯度均90%。1.2药物提取及分散取牛膝药材细粉1.5kg，放入圆顶烧瓶中，用75%乙醇加热回流提取3次，归并滤液，进一步减压接纳溶液得到乙醇提取浸膏。浸膏用水溶液，得到水混悬液。混悬液用石油醚萃取，萃取后保存石油醚层，放入棕色瓶中，混悬液用氯仿萃取，得到氯仿层。混悬液用正丁醇和醋酸乙酯萃取，别离得到了醋酸乙酯和正

4、丁醇层及水层。顺遂完成了提取事情。取牛膝醋酸乙酯层浸膏适量，用石油醚-丙酮举行梯度硅胶柱层析，溶剂梯度变革挨次为：石油醚-丙酮2001、石油醚-丙酮1001、石油醚-丙酮501、石油醚-丙酮201、石油醚-丙酮101、石油醚-丙酮51、石油醚-丙酮31、石油醚-丙酮21、石油醚-丙酮11、丙酮，每个溶剂梯度用5个层析硅胶柱的保存体积洗脱,每250l为一馏分，各馏分接纳溶剂后，用硅胶GF254薄层板查验各馏分身分，归并重要身分雷同的馏分1。当洗脱溶剂为石油醚-丙酮101时，网络馏分60-66，用硅胶制备薄层举行制备，以石油醚-丙酮51为睁开体系，氯仿-甲醇重结晶得化合物。当洗脱溶剂为石油醚-丙酮

5、21时，网络馏分192-199，经硅胶制备薄层举行制备，以氯仿-甲醇-水653510为睁开体系，氯仿-甲醇11重结晶得化合物。当洗脱溶剂为丙酮时，网络馏分202-214，经硅胶制备薄层举行制备，以醋酸乙酯-甲醇41为睁开体系，甲醇重结晶，反相高效液相色谱制备，以水-乙腈-四氢呋喃86113为活动相，得化合物。1.3含药细胞造就液的配制取从牛膝醇提物的醋酸乙酯层浸膏中分散得到的每种化合物约1g溶于1lDS中，配成1g/l的储藏液，举行细胞的增殖检测实行时，用无血清E依次稀释成1.0102，1.0103，1.0104，1.0105，1.0106，1.0107g/l6个浓度。2效果牛膝中分散得到的3

6、种化合物的断定：化合物：白色针晶，p139142，Lieberann-Burhard反响阳性，用以下面3种溶剂体系为睁开剂举行薄层色谱时：石油醚-丙酮51；环己烷-醋酸乙酯52；氯仿-石油醚-醋酸乙酯861，和比较品-谷甾醇Rf雷同，和比较品混淆后熔点不低落。故断定为-谷甾醇(-sitsterl)。化合物：白色粉末，p303305，Liberann-Burhard和lish反响均为阳性，用以下面3种溶剂体系为睁开剂举行薄层色谱时：甲醇-醋酸乙酯-冰乙酸642；醋酸乙酯-甲醇41；氯仿-甲醇-冰乙酸821，其Rf值和比较品胡萝卜苷同等，在以差异比例乙腈-水为活动相的高效液相色谱中，其保存时间和胡

7、萝卜苷比较品雷同，断定该化合物为胡萝卜苷dausterl。化合物：白色针晶，p241243，Lieberann-Burhard反响阳性，当以下面3种溶剂体系为睁开剂举行薄层色谱时：氯仿-甲醇-水653510下层；醋酸乙酯-甲醇41；氯仿-甲醇-冰醋酸721，其Rf值和蜕皮甾酮比较品同等；在以差异比例的甲醇-水、乙腈-水为活动相的高效液相色谱中，其保存时间和蜕皮甾酮比较品雷同，证明该化合物为蜕皮甾酮(edysterne)2。胡萝卜苷、蜕皮甾酮对成骨样细胞的增殖也表示出明显的促进作用，当其在细胞造就液中的浓度为1.2106g/l相称于药材2.4104g/l时，其促进成骨样细胞增殖的作用最强，3次实

8、行的最高增殖率均匀为45%。-谷甾醇对成骨样细胞的增殖既无明显的促进作用又无明显的按捺作用。3讨论牛膝的醇提物对成骨样细胞UR106有促进增殖的作用，增殖率可达27%，醇提物的醋酸乙酯萃取部位比醇提物具有更强的促进增殖作用，其增殖率可达55%。本研究以成骨样细胞UR106的增殖为活性指标，对醋酸乙酯层的身分举行活性追踪和化学分散，创造含量较高的化合物-蜕皮甾酮和胡萝卜苷对成骨样细胞UR106的增殖具有明显的促进作用，因此，确定蜕皮甾酮和胡萝卜苷为牛膝中对成骨样细胞UR106的增殖有明显促进作用的活性身分。对牛膝的醋酸乙酯层用硅胶柱色谱、薄层色谱、反相高效液相色谱平分散本领举行化学分散，得到3种含量较