DNA重组技术的基本工具

1、PAGE 用心 爱心 专心 116号编辑第1节 DNAA重组技技术的基基本工具具【本节重重难点】重点：DDNA重重组技术术所需的的三种基基本工具具的作用用难点：基基因工程程载体所所需要具具备的条条件【知识精精讲】教材梳理理知识点一一 基基因工程程的概念念：基因因工程是是指按照照人们的的愿望，进行严严格的设设计，并并通过体体外DNNA重组组和转基基因等技技术，赋赋予生物物以新的的遗传特特性，从从而创造造出更符符合人们们需要的的新的生生物类型型和生物物产品。由于基基因工程程是在DDNA分分子水平平上进行行设计和和施工的的，因此此又叫做做DNAA重组技技术。注意：对对本概念念应从以以下几个个方面理理

2、解：操作环境境生物体外外操作对象象基因操作水平平DNA分分子水平平基本过程程剪切拼拼接导入表达结果人类需要要的基因因产物知识点二二 基基因工程程的基本本工具1.限制制性核酸酸内切酶酶“分子手手术刀”（1）限限制性内内切酶的的来源：主要是是从原核核生物中中分离纯纯化来的的。（2）限限制性内内切酶的的功能：能够识识别双链链DNAA分子的的某种特特定的核核苷酸序序列，并并能将每每一条链链上特定定部位的的两个核核苷酸之之间的磷磷酸二酯酯键切开开。（3）限限制性内内切酶的的切割方方式：在中心心轴线两两侧将DDNA切切开，切切口是黏黏性末端端。沿着中中心轴线线切开DDNA，切口是是平末端端。注意：比比较有

3、关关的DNNA酶（1）DDNA水水解酶：能够将将DNAA水解成成四种脱脱氧核苷苷酸，彻彻底水解解成膦酸酸、脱氧氧核糖和和含氮碱碱基 （2）DDNA解解旋酶：能够将将DNAA或DNNA的某某一段解解成两条条长链，作用的的部位是是碱基和和碱基之之间的氢氢键。注注意：使使DNAA解成两两条长链链的方法法除用解解旋酶以以外，在在适当的的高温（如944）、重重金属盐盐的作用用下，也也可使DDNA解解旋。 （3）DDNA聚聚合酶：能将单单个的核核苷酸通通过磷酸酸二酯键键连接成成DNAA长链。 （4）DDNA连连接酶：是通过磷磷酸二酯酯键连接接双链DDNA的的缺口。注意比比较DNNA聚合合酶和DDNA连连接

4、酶的的异同点点。2.DNNA连接接酶“分子子缝合针针”（1）DDNA连连接酶的的分类：E.ccoliiDNAA连接酶酶和T44DNAA连接酶酶。（2）作作用及作作用部位位：E.colliDNNA连接接酶作用用于黏性性末端被被切开的的磷酸二二酯键，T4DNAA连接酶酶作用于于黏性末末端和平平末端被被切开的的磷酸二二酯键。3.基因因进入受受体细胞胞的载体体“分子运运输车”（1）分分子运载载车的分分类：质粒：常存在在于原核核细胞和和酵母菌菌中，是是一种分分子质量量较小的的环状的的裸露的的DNAA分子，独立于于拟核之之外。病毒：常用的的病毒有有噬菌体体、动植植物病毒毒等。（2）运运载体使使用的目目的：

5、是用它它做运载载工具，将目的的基因转转运到宿宿主细胞胞中去。是利用用它在受受体细胞胞内对目目的基因因进行大大量复制制。（3）作作为运载载体必须须具备的的条件：在宿主主细胞中中保存下下来并大大量复制制 有多个个限制性性内切酶酶切点 有一定定的标志志基因，便于筛筛选。思维探究究：知识识点3、4、55主要是是介绍DDNA重重组技术术的三种种基本工工具及其其作用。限制酶酶“分子手手术刀”，主要要是介绍绍限制酶酶的作用用，切割割后产生生的结果果。在这这部分内内容学习习时，应应关心的的问题之之一是：限制酶酶从哪里里寻找？我们可可以联想想从前学学过的内内容噬菌体体侵染细细菌的实实验，进进而认识识细菌等等单细

6、胞胞生物容容易受到到自然界界外源DDNA的的入侵。那么这这类原核核生物之之所以长长期进化化而不绝绝灭，有有何保护护机制？进而联联想到可可能是有有什么酶酶来切割割外源DDNA，而使之之失效，达到保保护自身身的目的的”。这这样就对对“限制酶主主要是从从原核生生物中分分离纯化化出来”的认识识提高了了一个层层次。DNA连连接酶DNNA片段段的“分分子缝合合针”，在这里里同学们们很容易易想到碱碱基互补补配对或或DNAA聚合酶酶，这是是很自然然的。但但只考虑虑到碱基基互补配配对原则则还是不不够的，我们可可以从原原有的知知识出发发，要想想到限制制酶切开开的DNNA中膦膦酸与脱脱氧核糖糖之间的的磷酸二二酯键，

7、这个地地方还没没有连接接起来，又是怎怎样连接接的呢？这样自自然而然然地想到到DNAA连接酶酶。基因进入入受体细细胞的载载体“分子子运输车车”的学学习内容容，不能能仅仅着着眼于记记住这几几个条件件，而应应该深入入思考每每一个条条件的内内涵，通通过深思思熟虑，才能真真正明确确为什么么要有这这些条件才才能充当当载体。教材拓展展拓展点一一 限限制酶所所识别序序列的特点限制酶所所识别的的序列的的特点是是：呈现现碱基互互补对称称，无论论是奇数数个碱基基还是偶偶数个碱碱基，都都可以找找到一条条中心轴轴线，如如图，中中轴线两两侧的双双链DNNA上的的碱基是是反向对对称重复复排列的的。如： 以中中心线为为轴，两

8、两侧碱基基互补对对称； 以 为为轴，两两侧碱基基互补对对称。拓展点二二 DDNA连连接酶连连接的是是什么部部位？DNA连连接酶是是将一段段DNAA片段33端的的羟基与与另一DDNA片片段5端磷酸酸基团上上的羟基基连接起起来形成成酯键，而不是是连接互互补碱基基之间的的氢键。【典题分分类精析析】考点一、基因工工程的概概念例1（20005高考考广东）以下有有关基因因工程的的叙述，正确的的是 （ ）A、基因因工程是是细胞水水平上的的生物工工程 BB、基因因工程的的产物对对人类都都是有益益的C、基因因工程产产生的变变异属于于人工诱诱变 DD、基因因工程育育种的优优点之一一是目的的性强分析：本本题考查查的

9、知识识点是基基因工程程的概念念。解答本本题的关关键是理理解基因因工程的的概念。基因工工程是在在生物体体外，通通过对DDNA分分子进行行人工“剪切”和“拼拼接”，对生物物的基因因进行改改造(目目的性强强)和重重新组合合(基因因重组)，然后后导入受受体细胞胞内进行行无性繁繁殖，使使重组基基因在受受体细胞胞内表达达，产生生出人类类所需要要的基因因产物.但并不不是所有有的基因因产物对对人类都都有益的的。所以以选D。答案：DD 点评：正正确理解解基因工工程的概概念是解解题的关关键。 考点二、基因工工程的基基本工具具例2.下下列关于于限制酶酶的说法法不正确确的是A限制制酶广泛泛存在于于各种生生物中，微生物

10、物中很少少分布B一种种限制酶酶只能识识别一种种特定的的核苷酸酸序列C不同同的限制制酶切割割DNAA的切点点不同D限制制酶的作作用是用用来提取取目的基基因分析：此此题主要要考察限限制酶的的有关知知识。解解答本题题的关键键是理解解限制酶酶的来源源和限制制酶的特特点。限限制酶主主要是从从原核生生物中分分离出来来的，并并不是广广泛存在在于各种种生物中中；一种种限制酶酶能识别别双链DDNA的的某种特特定核苷苷酸序列列，并且且使每一一条链中中特定部部位的两两个核苷苷酸之间间的磷酸酸二酯键键断开；DNAA分子经经限制酶酶切割形形成黏性性末端和和平末端端两种。答案：BB点评：考考察有关关限制酶酶的题目目，主要

11、要是考察察限制酶酶的特点点，这一一点一定定要牢记记。例3在在基因工工程中用用来完成成基因的的剪接的的工具是是A限制制酶和连连接酶 B限限制酶和和水解酶酶C限制制酶和运运载体 D连接接酶和运运载体分析：本本题考查查限制酶酶和连接接酶的有有关知识识。解答答本题的的关键是是“剪接”二字，是既剪剪又接。限制性性内切酶酶(即限限制酶)是剪切切基因的的“剪刀”，DNNA连接接酶是将将DNAA末端之之间的缝缝隙“缝合”起来的的“基因的的针线”。所以以，剪接接工具是是限制酶酶和连接接酶。答案：AA点评：本本题注意意审题，剪接是是既剪又又接，需需要限制制酶和连连接酶。例4有有关基因因工程的的叙述正正确的是是A限

12、制制酶只在在获取目目的基因因时才用用B重重组质粒粒的形成成是在细细胞内完完成的C质粒粒都可以以作为运运载体D蛋白白质的氨氨基酸排排列顺序序可以为为合成目目的基因因提供线线索分析：本本题综合合考察了了基因工工程中所所用到的的工具。在基因因工程中中，不仅仅要用限限制酶切切割目的的基因，还要用用同一种种限制酶酶在质粒粒上切割割出一个个切口，使目的的基因与与质粒切切口的黏黏性末端端能进行行碱基互互补配对对，所以以A错；重组质质粒是在在细胞外外进行的的，所以以B错；并不是是所有的的质粒都都可作运运载体，在科学学研究中中，人们们通常只只是用大大肠杆菌菌的质粒粒(其上上有抗药药基因)作运载载体，所所以C错错

13、；在人人工合成成目的基基因的方方法中，有一种种方法是是根据已已知蛋白白质的氨氨基酸序序列，推推测出相相应的mmRNAA序列，然后按按照碱基基互补配配对原则则，推测测出它的的结构基基因的核核苷酸序序列，最最后通过过化学方方法，以以单核苷苷酸为原原料合成成目的基基因。所所以D项项正确。答案：DD点评：解解答本题题时要综综合考虑虑基因工工程的基基本工具具的特点点、条件件、适用用范围。例5下下列哪项项通常不不被用作作基因工工程的运运载体A细菌菌质粒 B噬噬菌体C动植植物病毒毒 D细菌核核区的DDNA分析：本本题考察察基因工工程中的的工具运载载体。解解答本题题的关键键是记住住、理解解运载体体必须具具备的

14、条条件和课课本上讲讲的常用用运载体体。作为为运载体体必须具具备的条条件：在宿主主细胞中中保存下下来并大大量复制制 有多个个限制性性内切酶酶切点 有一定定的标志志基因，便于筛筛选。记记住常用用的运载载体有：质粒、噬菌体体、动植植物病毒毒等。细细菌的核核区由一一个大型型的环状状DNAA分子反反复折叠叠缠绕而而成，控控制着细细菌的主主要性状状，所以以一般不不被用作作基因工工程的运运载体。答案：DD点评：牢牢记作为为运载体体必须具具备的33个条件件是解答答本题的的关键。考点三、限制酶酶所识别别序列的的特点例620005天津津（11）限制制性内切切酶的的识别序序列和切切点是GGGATCCC，限制性性内切

15、酶酶的识识别序列列和切点点是GATTC。在质粒粒上有酶酶的一个个切点，在目的的基因的的两侧各各有1个个酶的的切点。请画出出质粒被被限制酶酶切割后后形成的的黏性未未端。_请画出出目的基基因两侧侧被限制制酶切割后后形成的的黏性未未端。_在DNNA连接接酶的作作用下，上述两两种不同同限制酶酶切割后后形成的的黏性未未端能否否连接起起来？为为什么？_分析：本本题主要要考察黏黏性末端端的知识识。解答答本题的的关键是是理解限限制酶的的特点。在切割割目的基基因和运运载体时时，一定定要使用用同一种种限制性性内切酶酶，这样样，切出出的切口口才一样样，才能能进行碱碱基互补补配对连连接起来来。两个个黏性末末端只要要一

16、样就就可以进进行碱基基互补配配对，再再通过DDNA连连接酶连连接起来来。答案：（1）可以以连接。因为由由两种限限制性内内切酶切切割后所所形成的的黏性末末端是相相同的（或“是可以以互补的的”）。点评：限限制酶所所识别的的是特定定的碱基基序列，并在特特定部位位进行切切割，限限制酶不不同，所所识别的的碱基序序列不同同，黏性性末端不不同。但但不同的的粘性末末端有时时是可以以进行拼拼接的，如：黏黏性末端端。两者者不要混混淆。【针对性性练习】1实施施基因工工程第一一步的一一种方法法是把所所需的基基因从供供体细胞胞内分离离出来，这要利利用限制制性内切切酶。一一种限制制性内切切酶能识识别DNNA子中中的GAA

17、ATTTC顺序序，切点点在G和和A之间间，这是是应用了了酶的A酶的的高效性性 BB酶的专专一性CC酶的的多样性性 D酶的催催化活性性受外界界条件影影响2以下下说法正正确的是是 A所有的的限制酶酶只能识识别同一一种特定定的核苷苷酸序列列B质质粒是基基因工程程中惟一一的运载载体C运载体体必须具具备的条条件之一一是：具具有多个个限制酶酶切点，以便与与外源基基因连接接D基基因治疗疗主要是是对有缺缺陷的细细胞进行行修复33.下列列黏性末末端属于于同一种种限制性性内切酶酶切割的的是（ ）ABCD4.下列列四条DDNA分分子，彼彼此间具具有粘性性末端的的一组是是 A B C D5依右右图有关关基因工工程的工

18、工具酶功功能的叙叙述，不不正确的的是 A切断断a处的的酶为限限制核酸酸性内切切酶 B连接接a处的的酶为DDNA连连接酶C切断断b处的的酶为解解旋酶 D切断断b处的的为限制制性内切切酶6不属属于质粒粒被选为为基因运运载体的的理由是是 AA能复复制 BB有多多个限制制酶切点点C具有标标记基因因 D它是环环状DNNA7.基因因工程技技术也称称为DNNA重组组技术，其实施施必须具具备的四四个必要要条件是是A.目的的基因 限制性性内切酶酶 运载体体 体细细胞 B.重组组DNAA RNNA聚合合酶 限制制性内切切酶 连连接酶C.工具具酶 目的基基因 运载体体 受体体细胞D.模板板DNAA 信使使RNAA

19、质质粒 受体体细胞8下列列关于各各种酶作作用的叙叙述，不不正确的的是ADNNA连接接酶能使使不同脱脱氧核苷苷酸的磷磷酸与脱脱氧核糖糖连接BRNNA聚合合酶能与与基因的的特定位位点结合合，催化化遗传信信息的转转录C一种种DNAA限制酶酶能识别别多种核核苷酸序序列，切切割出多多种目的的基因D胰蛋蛋白酶能能作用于于离体的的动物组组织，使使其分散散成单个个细胞9.下列列关于限限制酶的的说法不不正确的的是A.限制制酶广泛泛存在于于各种生生物中，尤其在在微生物物细胞中中分布最最多B.不同同的限制制酶识别别不同的的核苷酸酸序列C.限制制酶能识识别不同同的核苷苷酸序列列，体现现了酶的的专一性性D.限制制酶的作

20、作用只是是用来提提取目的的基因10有有关基因因工程的的叙述中中，不正确的的是 A.DNNA连接接酶将黏黏性未端端的碱基基对连接接起来 BB.限制制性内切切酶可用用于目的的基因的的获得 C.目的的基因须须由运载载体导入入受体细细胞D.人工合合成目的的基因不不用限制制性内切切酶11下下图所示示限制酶酶切割基基因分子子的过程程，从图图中可知知，该限限制酶能能识别的的碱基序序列和切切点是ACTTTAAAG，切切点在CC和T之之间 BCTTTAAGG，切点点在G和和A之间间CGAAATTTC，切切点在GG和A之之间 DGAAATTCC，切点点在C和和T之间间 12.下下列关于于质粒的的叙述，正确的的是（

21、）A、质粒粒是广泛泛存在于于细菌细细胞中的的一种颗颗粒状细细胞器B、质粒粒是细菌菌细胞质质中能够够自主复复制的小小型环状状DNAA分子C、质粒粒只有在在导入宿宿主细胞胞后才能能在宿主主细胞内内复制D、细菌菌质粒的的复制过过程一定定是在宿宿主细胞胞外独立立进行的的13科科学家常常选用的的细菌质质粒往往往带有一一个抗菌菌素抗性性基因，该抗性性基因的的主要作作用是A提高高受体细细胞在自自然环境境中的耐耐热性 B有利于于检测目目的基因因否导入入受体细细胞C增加加质粒分分子的相相对分子子质量 D便于与与外源基基因连接接14下下图是基基因工程程主要技技术环节节的一个个基本步步骤，这这一步需需用到的的工具是

22、是ADNNA连接接酶和解解旋酶 BDNAA聚合酶酶和限制制性核酸酸内切酶酶C限制制性核酸酸内切酶酶和DNNA连接接酶 DDNAA聚合酶酶和RNNA聚合合酶15限限制酶是是一种核核酸切割割酶，可可辨识并并切割DDNA分分子上特特定的核核苷酸碱碱基序列列。下图图为四种种限制酶酶BammHI，EcooRI，Hinnd以及Bggl的辨识识序列。箭头表表示每一一种限制制酶的特特定切割割部位，其中哪哪两种限限制酶所所切割出出来的DDNA片片段末端端可以互互补黏合合？其正正确的末末端互补补序列为为何？A. BBamHHI和EcooRI；末末端互补补序列AATTTB. BBamHHI和Hinnd；末端端互补序

23、序列GATTCC. EEcoRRI和Hinnd；末端端互补序序列AATTTD. BBamHHI和BgllII；末末端互补补序列GATTC16在在DNAA 测序序工作中中，需要要将某些些限制性性内切核核酸酶的的限制位位点在 DNAA上定位位，使其其成为 DNAA 分子子中的物物理参照照点。这这项工作作叫做“限制酶酶图谱的的构建”。假设设有以下下一项实实验：用用限制酶酶Hinnd，BaamH和二者者的混合合物分别别降解一一个 44kb（1kbb即1千千个碱基基对）大大小的线线性DNNA 分分子，降降解产物物分别进进行凝胶胶电泳，在电场场的作用用下，降降解产物物分开，如下图图所示。据此分析析，这两两

24、种限制制性内切切核酸酶酶在该DDNA 分子上上的限制制位点数数目是以以下哪一一组？AHiind1个，BammH2个BHHindd2个，BammH3个CHiind2个，BammH1个DHHindd和BaamH各有2 个17.两两个核酸酸片段在在适宜的的条件下下，经XX酶的作作用，发发生下述述变化，则X酶酶是A.连接接酶 B.RNAA聚合酶酶 C.DDNA聚聚合酶 D.限限制酶18基基因工程程中涉及及多种工工具酶：（1）限限制性内内切酶是是一类能能识别特特定核苷苷酸序列列并在特特定位点点切割双双链DNNA的“基因剪剪刀”。被限限制酶识识别的序序列往往往正反读读顺序相相同，断断裂的位位置交错错，但又

25、又是围绕绕着一个个轴线（对称轴轴）对称称排列，如下左左图。PPstII和EccoRII都是限限制酶。请补全全下右图图中的互互补链，画出对对称轴以以及切割割后的产产物。（2）DDNA连连接酶是是基因操操作的“针线”，其作作用是把把基于能能力而粘粘贴在一一起但存存在的切切口封闭闭，进而而才可能能形成有有意义的的。（3）逆逆转录酶酶也常被被用于基基因工程程，其存存在于（生物）中，催催化以为为模板合合成DNNA的过过程。19.利利用基因因工程生生产蛋白白质药物物，经历历了三个个发展阶阶段。第第一阶段段，将人人的基因因转入细细菌细胞胞；第二二阶段，将人的的基因转转入小鼠鼠等动物物的细胞胞。前两两个阶段段

26、都是进进行细胞胞培养，提取药药物。第第三阶段段，将人人的基因因转入活活的动物物体，饲饲养这些些动物，从乳汁汁或尿液液中提取取药物。（1）将将人的基基因转入入异种生生物的细细胞或个个体内，能够产产生药物物蛋白的的原理是是基因能能控制。（2）人人的基因因能和异异种生物物的基因因拼接在在一起，是因为为它们的的分子都都具有双双螺旋结结构，都都是由四四种_构成成，基因因中碱基基配对的的规律都都是_。（3）人的基基因在异异种生物物细胞中中表达成成蛋白质质时，需需要经过过和翻译译两个步步骤。在在翻译中中需要的的模板是是，原料料是氨基基酸，直直接能源源是ATTP，搬搬运工兼兼装配工工是，将将氨基酸酸的肽键键连

27、接成成蛋白质质的场所所是_，“翻翻译”可可理解为为将由_个“字字母”组组成的核核酸“语语言”翻翻译成由由个“字字母”组组成的蛋蛋白质“语言”，从整整体来看看在翻译译中充任任着“译译员”。（4）利用转转基因牛牛、羊乳汁汁提取药药物工艺艺简单，甚至可可直接饮饮用治病病。如果果将药物物蛋白基基因移到到动物如如牛、羊的膀膀胱上皮皮细胞中中，利用用转基因因牛羊尿尿液生产产提取药药物比乳乳汁提取取药物的的更大优优越性在在于：处处于不同同发育时时期的动动物都可可生产药药物。20.在在某一特特定的植植物基因因工程中中，用土土壤农杆杆菌中的的Ti质质粒作为为运载体体。把目目的基因因重组入入Ti质质粒上的的T-D

28、DNA片片段中，再将重重组的TT-DNNA插入入植物细细胞的染染色体DDNA中中。(1)科科学家在在进行上上述基因因操作时时，要用用同一种种分别切切割质粒粒和目的的基因，质粒的的黏性末末端与目目的基因因DNAA片段的的黏性末末端就可可通过而而黏合。(2)将将携带抗抗除草剂剂基因的的重组TTi质粒粒导入二二倍体油油菜细胞胞，经培培养、筛筛选获得得一株有有抗除草草剂特性性的转基基因植株株。经分分析，该该植株含含有一个个携带目目的基因因的T-DNAA片段，因此可可以把它它看作是是杂合子子。理论论上，在在该转基基因植株株自交FF1代中，仍具有有抗除草草剂特性性的植株株占总数数的， (3)种种植上述述转

29、基因因油菜，它所携携带的目目的基因因可以通通过花粉粉传递给给近缘物物种，造造成“基因污污染”。如果果把目的的基因导导入叶绿绿体DNNA中，就可以以避免“基因污污染”，原因因是 。【课后答答案点拨拨】思考与探探究（PP7）1. 不不能。连连接如下下： 2和7能能连接形形成：ACCGTTGCCA；4和8能能连接形形成：GAAATTTCCTTTAAGG；3和6能能连接形形成：GCCGCCGCCG；1和5能能连接形形成：CTTGCAAGGACCGTCC。解析：限限制酶具具有特异异性，一一种限制制酶只能能识别特特定的碱碱基序列列，并在在特定的的部位切切开。2.联系系你已有有的知识识，想一一想，为为什么细

30、细菌中限限制酶不不剪切细细菌本身身的DNNA？解析：迄迄今为止止，基因因工程中中使用的的限制酶酶绝大部部分都是是从细菌菌或霉菌菌中提取取出来的的，它们们各自可可以识别别和切断断DNAA上特定定的碱基基序列。细菌中中限制酶酶之所以以不切断断自身DDNA，是因为为微生物物在长期期的进化化过程中中形成了了一套完完善的防防御机制制，对于于外源入入侵的DDNA可可以降解解掉。生生物在长长期演化化过程中中，含有有某种限限制酶的的细胞，其DNNA分子子中或者者不具备备这种限限制酶的的识别切切割序列列，或者者通过甲甲基化酶酶将甲基基转移到到所识别别序列的的碱基上上，使限限制酶不不能将其其切开。这样，尽管细细菌

31、中含含有某种种限制酶酶也不会会使自身身的DNNA被切切断，并并且可以以防止外外源DNNA的入入侵（本本题不要要求学生生回答的的完全，教师可可参考教教师用书书中的提提示，根根据学生生的具体体情况，给予指指导。上上述原则则也应适适用于其其他章节节中有关关问题的的回答。）。3.天然然的DNNA分子子可以直直接用做做基因工工程载体体吗？为为什么？解析：基基因工程程中作为为载体使使用的DDNA分分子很多多都是质质粒（pplassmidd），即即独立于于细菌拟拟核处染染色体DDNA之之外的一一种可以以自我复复制、双双链闭环环的裸露露的DNNA分子子。是否否任何质质粒都可可以作为为基因工工程载体体使用呢呢？

32、其实实不然，作为基基因工程程使用的的载体必必需满足足以下条条件。（1）载载体DNNA必需需有一个个或多个个限制酶酶的切割割位点，以便目目的基因因可以插插入到载载体上去去。这些些供目的的基因插插入的限限制酶的的切点所所处的位位置，还还必须是是在质粒粒本身需需要的基基因片段段之外，这样才才不至于于因目的的基因的的插入而而失活。（2）载载体DNNA必需需具备自自我复制制的能力力，或整整合到受受体染色色体DNNA上随随染色体体DNAA的复制制而同步步复制。（3）载载体DNNA必需需带有标标记基因因，以便便重组后后进行重重组子的的筛选。（4）载载体DNNA必需需是安全全的，不不会对受受体细胞胞有害，或不

33、能能进入到到除受体体细胞外外的其他他生物细细胞中去去。（5）载载体DNNA分子子大小应应适合，以便提提取和在在体外进进行操作作，太大大就不便便操作。实际上自自然存在在的质粒粒DNAA分子并并不完全全具备上上述条件件，都要要进行人人工改造造后才能能用于基基因工程程操作。4.网上上查询：DNAA连接酶酶有连接接单链DDNA的的本领吗吗？解析：迄迄今为止止，所发发现的DDNA连连接酶都都不具有有连接单单链DNNA的能能力，至至于原因因，现在在还不清清楚，也也许将来来会发现现可以连连接单链链DNAA的酶。P4寻根根问底：根据你所所掌握的的知识，你能分分析出限限制酶存存在于原原核生物物中的作作用是什什么

34、吗？解析：原原核生物物容易受受到自然然界外源源DNAA的入侵侵，但是是，生物物在长期期的进化化过程中中形成了了一套完完善的防防御机制制，以防防止外来来病原物物的侵害害。限制制酶就是是细菌的的一种防防御性工工具，当当外源DDNA侵侵入时，会利用用限制酶酶将外源源DNAA切割掉掉，以保保证自身身的安全全。所以以，限制制酶在原原核生物物中主要要起到切切割外源源DNAA、使之之失效，从而达达到保护护自身的的目的。寻根问底底（P66）：DNA连连接酶与与DNAA聚合酶酶是一回回事吗？为什么么？答：不是是一回事事。基因因工程中中所用的的连接酶酶有两种种：一种种是从大大肠杆菌菌中分离离得到的的，称之之为E.

35、colli连接接酶。另另一种是是从T44噬菌体体中分离离得到，称为TT4连接接酶。这这两种连连接酶催催化反应应基本相相同，都都是连接接双链DDNA的的缺口（nicck），而不能能连接单单链DNNA。DDNA连连接酶和和DNAA聚合酶酶都是形形成磷酸酸二酯键键（在相相邻核苷苷酸的33位碳原原子上的的羟基与与5位碳碳原子上上所连磷磷酸基团团的羟基基之间形形成），那么，二者的的差别主主要表现现在什么么地方呢呢？（1）DDNA聚聚合酶只只能将单单个核苷苷酸加到到已有的的核酸片片段的33末端端的羟基基上，形形成磷酸酸二酯键键；而DDNA连连接酶是是在两个个DNAA片段之之间形成成磷酸二二酯键，不是在在单

36、个核核苷酸与与DNAA片段之之间形成成磷酸二二酯键。（2）DDNA聚聚合酶是是以一条条DNAA链为模模板，将将单个核核苷酸通通过磷酸酸二酯键键形成一一条与模模板链互互补的DDNA链链；而DDNA连连接酶是是将DNNA双链链上的两两个缺口口同时连连接起来来。因此此DNAA连接酶酶不需要要模板。此外，二二者虽然然都是由由蛋白质质构成的的酶，但但组成和和性质各各不相同同。模拟制作作讨论题题（P66）：1. 你你模拟插插入的DDNA片片段能称称得上一一个基因因吗？提示：不不能。因因为一般般基因有有上千个个碱基对对。2. 如如果你操操作失误误，碱基基不能配配对。可可能是什什么原因因造成的的？解析：可可能

37、是剪剪切位点点或连接接位点选选得不对对（也可可能是其其他原因因）。P6旁栏栏思考题题：想一想，具备什什么条件件才能充充当“分分子运输输车”？解析：能能自我复复制、有有一个或或多个切切割位点点、有标标记基因因位点及及对受体体细胞无无害等。【拓展阅阅读】1.磷酸酸二酯键键磷酸二酯酯键全称称为3,5磷酸二二酯键，是核酸酸中核苷苷酸的连连接方式式，组成成了核酸酸的一级级结构。在核酸酸中一个个核苷酸酸核糖上上第3位位的羟基基与下一一个核苷苷酸核糖糖上第55位的磷磷酸羟基基脱水缩缩合成酯酯键，该该酯键称称3,5磷酸二二酯键。若干个个核苷酸酸间以33,55磷酸二二酯键连连接成的的多核苷苷酸链为为核酸。在链的

38、的一端的的一个核核苷酸核核糖上第第5位连连接的磷磷酸只有有一个酯酯键，称称此核苷苷酸为DDNA链链的5磷酸末末端或55端。另一端端核苷酸酸上第33位的羟羟基是自自由的，所以此此核苷酸酸称为33羟基基末端或或3端端。链内内的核苷苷酸第55位上的的磷酸已已形成二二酯键，第3位位上的羟羟基也已已参与二二酯键的的形成，故称核核苷酸残残基。2.影响响限制性性内切酶酶活性的的因素（1）DDNA纯纯度在DDNA样样品中若若含有蛋蛋白质，或没有有去除干干净制备备过程中中所用的的乙醇、EDTTA、SSDS、酚、氯氯仿和某某些高浓浓度金属属离子，均会降降低限制制酶的催催化活性性，甚至至使限制制酶不起起作用。（2）

39、核核酸内切切限制酶酶的缓冲冲液核酸酸内切限限制酶的的标准缓缓冲液包包括氯化化镁、氯氯化钠或或氯化钾钾、Trris-HCLL、巯基基乙醇或或二硫苏苏糖醇(DTTT)以及及牛血清清白蛋白白(BSSA)等等。使用用所有限限制酶均均可发挥挥活性的的一种缓缓冲液。不同限限制性内内切酶对对NaCCl浓度度的要求求不同，这是不不同限制制酶缓冲冲液组成成上的一一个主要要的不同同。据此此可分为为高盐、中盐和和低盐缓缓冲液，在进行行双酶解解或多酶酶解时，若这些些酶切割割可在同同种缓冲冲液中作作用良好好，则几几种酶可可同时酶酶切；若若这些酶酶所要求求的缓冲冲液有所所不同，可采用用以下三三种方法法进行消消化反应应：先

40、用用要求低低盐缓冲冲液的限限制性内内切酶消消化DNNA，然然后补足足适量的的NaCCl，再再用要求求高盐缓缓冲液的的限制酶酶消化；先用一一种酶进进行酶解解，然后后用乙醇醇沉淀酶酶解产物物，再重重悬于另另一缓冲冲液中进进行第二二次酶解解。（3）酶酶切消化化反应的的温度DDNA消消化反应应的温度度，是影影响限制制内切酶酶活性的的一个重重要因素素。不同同的核酸酸内切限限制酶，具有各各自的最最适反应应温度。多数限限制内切切酶的最最适反应应温度是是37，少数数限制性性内切酶酶的最适适反应温温度高于于或低于于37。（4）DDNA的的分子结结构DNNA分子子构型对对核酸内内切限制制酶的活活性有很很大影响响，

41、如消消化超螺螺旋的DDNA比比消化线线性DNNA用酶酶量要高高出许多多倍。有有些限制制酶在消消化它们们自己的的处于不不同部位位的限制制位点，其效率率也有明明显差异异。限制制性内切切酶反应应的终止止 通常常是采用用65条件下下温浴55minn；加终终止反应应液（如如0.55moll/L的的EDTTA使之之在溶液液中的终终浓度达达到100 mool/LL）螯合合Mg22 ，以以终止反反应。【五年高高考回放放】1220066四川高高考用用基因工工程技术术可使大大肠杆菌菌合成人人的蛋白白质。下下列叙述述不正确确的是( )A常用用相同的的限制性性内切酶酶处理目目的基因因和质粒粒BDNNA连接接酶和DDN

42、A聚聚合酶是是构建重重组质粒粒必需的的工具酶酶C可用用含抗生生素的培培养基检检测大肠肠杆菌中中是否导导入了重重组质粒粒D导入入大肠杆杆菌的目目的基因因不一定定能成功功表达答案：BB 解析：构构建重组组质粒必必需的工工具酶是是限制性性内切酶酶和DNNA连接接酶，其其作用部部位是磷磷酸与脱脱氧核糖糖之间的的磷酸二二酯键，而DNNA聚合合酶的作作用是在在DNAA复制过过程中用用于连接接碱基间间的氢键键，故BB选项错错误。2220066江苏高高考我我国科学学家运用用基因工工程技术术，将苏苏云金芽芽孢杆菌菌的抗虫虫基因导导入棉花花细胞并并成功表表达，培培育出了了抗虫棉棉。下列列叙述不不正确的的是 ( )

43、A基因因非编码码区对于于抗虫基基因在棉棉花细胞胞中的表表达不可可缺少B重组组DNAA分子中中增加一一个碱基基对，不不一定导导致毒蛋蛋白的毒毒性丧失失C抗虫虫棉的抗抗虫基因因可通过过花粉传传递至近近缘作物物，从而而造成基基因污染染D转基基因棉花花是否具具有抗虫虫特性是是通过检检测棉花花对抗生生素抗性性来确定定的答案：DD 解析：基基因具有有特异性性，一种种基因只只能控制制一种性性状的表表达。抗抗虫基因因能表达达出致毒毒蛋白，导致害害虫因食食用抗虫虫棉后死死亡 ，而不能能产生对对抗生素素的抗性性。因此此，转基基因棉花花是否具具有抗虫虫特性是是不能通通过检测测棉花抗抗生素的的抗性对对来确定定的。3220055江苏高高考在植物物基因工工程中，用土壤壤农杆菌菌中的TTi质粒粒作为运运载体把目的的基因重重组入TTi质粒粒上的TT-DNNA片段段中，再再将重组组的T-DNAA插入植植物细胞胞的染色色体DNNA中。(1)科科学家在在进行上上述基因因操作时时，要用用同一种种分别切切割质粒粒和目的的基因，质粒的的黏性末末端与目目的基因因DNAA片段的的黏性末末端就可可通过而而黏合。(2)将将携带抗抗除草剂剂基因的的重组TTi质粒粒导入二二倍体油油菜细胞胞，经培培养、筛筛选获得得一株有有抗除草草剂特性性的转基基因植株株。经分分析，该该植株含含有一个个携带目目的基因