乳酸菌培养及诱导培养基

1、嗜酸乳杆菌 试验方法 一株嗜酸乳杆菌产共轭亚油酸条件的优化 J. 中国酿造，2009 1、基础培养基（脱脂乳培养基）12.0 g脱脂奶粉，蒸馏水100 mL, pH自然，115C灭菌20 min。2、MRS 固体培养基葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸膏5.0g, 无水乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，MgSO4 7H2O 0.58g，MnSO4 H2O 0. 33g,琼脂15g, pH 6.8左右，加蒸馏水至1000mL，121C灭菌20min。3、产酶培养基：脱脂乳培养基，并加入一定浓度的亚油酸来诱导产酶。出发菌株的活化及纯化保藏的嗜酸乳杆

2、菌接种于液体MRS培养基，摇匀后置36C恒温箱中培养 12h，接种于液体培养基中活化2次。划线接种到MRS固体培养基，36C恒温培*养36h，嗜酸乳杆菌在120r / min的状态下培养有利于嗜酸乳杆菌的繁殖。长 出单个菌落后，挑取菌落进行革兰氏染色镜检，确定是否纯种。嗜酸乳杆菌的形态与菌落特征在 MRS 琼脂培养基上需氧培养 48h 后，菌落微小，不规则，微隆起，有光 泽，灰白色，呈透明的玻璃霜花样。 10 倍显微镜观察表面凸凹不平，边缘为丝 状或卷发样。革兰氏染色后可见菌体呈短杆状，单个或短链状排列，革兰氏染色 阳性。肉眼观察， 嗜酸乳杆菌菌落较小,平台状， 不规则、圆形凸起、边缘整 齐、

3、质地柔软、灰白色、有光泽。1）500mL MRS 液体培养基2）5 个 250mL 的三角瓶，橡胶塞，牛皮纸，绳子3）5 个培养皿4）1 个接种环，酒精灯，打火机，酒精种子的制备活化的菌种接种于基础培养基，于36C恒温培养24 h,保藏备用。增菌培养基最佳接种量为3% （活菌数为108个/mL） 产酶诱导培养用脱脂乳配成12%的产酶液体培养基，每250mL三角瓶中装入100mL（含 12g脱脂乳、1.50%。亚油酸），加入1mL吐温80, 115C灭菌30 min后，接入2 mL 种子液（每mL含菌体5X108个），36C培养36h。lOOmL三角瓶装40mL的脱脂乳(含4.8g脱脂乳、1.5

4、0%。亚油酸)，将活化 后的菌种按3%接种(接种量为1.2mL),混匀，在36C下静止培养36h。并添加 0.1%(m/v)的乳糖，0.1%的硫酸铵，0.1%的氯化钠。1) 5个100mL的三角瓶第一次直接添加LA比较好，且LA添加量为1.50% 反应温度为 36C发酵时间为 36h第二次(回归正交)每个试样平行 3 次。(菌种接种量 2%、 3%、 4%、 5%、 6%)(发酵时间为 12h、 24h、 36h、 48h)(D-果糖添加量 0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(m/v)果糖为产CLA的最佳碳源(硫酸铵添加量 0、 0.5%、 1.0%、 1.5%、 2.0%(m/v)

5、) 结合有机物牛肉膏更有利于乳酸菌的生长， CLA 产量也最高。硫酸铵的添加量 增加CLA产量反而有所减少。铵离子被吸收会导致培养基的pH下降不利于CLA 的产生。探于国萍，寇秀颖.产共轭亚油酸乳酸菌的选育及培养基的确定J.食品工业 科技，2005,26(5):60 62.(氯化钠添加量 0、 0.05%、 0.10%、 0.15%、 0.20%(m/v) )(直接添加 LA 比较好，且 LA 添加量为 0.50%。、1.00%。、1.50%。、2.00% (v/v) (反应温度为 25C、 30C、 36C、 40C)(发酵时间为 12h、 24h、 36h、 48h)考察菌体接种量、亚油酸

6、(LA)的添加量、反应温度等因素对菌株嗜酸乳杆菌 转化培养条件的影响。分离纯化培养结束后离心高速冷冻离心机 (6000r/m ， 10min ， 4C )收集菌体细胞。 用蒸馏水洗涤 2次，离心后称重，及得生物量。离心后加入 4倍体积的 pH4.0 的缓冲液混匀，以0.5%(m/v)的量添加溶菌酶(30 C保温，1h)，然后再使用 超声波细胞破碎仪(超声3s，间歇4s，90次，400W)在冰水浴中进行细胞破 碎。破碎完成后进行离心 (8000r/m ， 10min ， 4C )，所得上清液及为粗酶液。 粗酶液的合成反应取上述制取粗酶 液 5mL 加 2mLLA 乳 浊液底物(5% LA+5%

7、Tween80+90% pH4.0缓冲液，放入冰水浴中超声 10min，功率400w)，放 在摇床中30C，120r/min反应3h。反应结束后，待测。共轭亚油酸的检测脂肪酸的提取反应后的溶液中加入 5ml 正己烷，充分震荡萃取，静置后待分层，收 集上清液，在正己烷溶液中加如无水NH3SO4吸水干燥。与30C旋转蒸发, 去除有机溶剂，将余下的液体收集在试管中待测。GC-MS 检测共轭亚油酸以未接入菌种、其他步骤和条件同上的情况下所得到的正己烷萃取液为参 比、正己烷为溶剂，于波长200nm300nm处扫描样品，观察波长233nm处有 无特征吸收峰。若在该波长处有特征吸收峰者，表明其发酵液中有CL

8、A生成， 读取波长234nm处吸光度值，根据CLA标准曲线所得CLA浓度，计算发酵液 中 CLA 的生成量。用 UV-1600 可见紫外分光光度计在 190nm 300nm 对共轭亚油酸进行 波长扫描，以确定其最大的吸收波长。其波长扫描图如图2.1 ，得其最大吸收波长 233nm。图 2.1 CLA 最大吸收波长扫描图Fig.2.1 Absorption wave maximum of CLA*张智，余 萍嗜酸乳杆菌的筛选及培养基的优化J.中国乳品工业,2007,35(6)：2527.陈洪仪，杨楠.嗜酸乳杆菌培养的研究J.现代食品科技,2009, 25(6):656 660.张浩，曹 健，张国

9、艳保加利亚乳杆菌中德亚油酸异构酶的研究J.食品 研究与开发, 2006, 127(7): 102107.3.璘酸塩一-钠-柠摄酸邂冲滝卩|U.2molAjNaHPOd(毫升)0.1 mol/L 柠様酸（毫升）2.21两L0.602.41.24LK.762.)2.18L7.K22.83.171,6.83加4.1 L115.89工24.9415.063.45.7()14,306.4413,563.S7.IULZSO丄U7.7112.194J8.281 l.：r.;4.48.8?1 1.184rh9,3510.654主9.8610.145.01 D.309,701心OJmol/.MHPOa(毫n、U. Iim?l/L 柠檬战 仇升）工二ID.729.2S5 411.15S.S55.611 60K.4U5.812.097 916.012.637.376.2IU26 786413.856.156.614.555.456.&15.4?4357.016.473.5?7.：门39.!.f，i7.J18.17i时7.618,731 277.R19.15LkS