高效液相色谱分析 (5)PPT

1、关于高效液相色谱分析 (5)第一张，PPT共四十二页，创作于2022年6月该方法的几个突出特点：(1)高压： 液相色谱以液体作为流动相(称为载液)，液 体流经色谱柱受到的阻力较大，为使载液迅 速通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般 可达到150300kg/cm2。(2)快速： 由于使用了高压，HPLC所需的时间较之经典 液相色谱短得多，如分离苯的羟基化合物七 个组分，只需1分钟；对氨基酸的分离，第二张，PPT共四十二页，创作于2022年6月经典液相色谱需用20小时才能分离出20种氨基酸，而HPLC只需1小时即可完成。载液在色谱柱内的流速可达110mLmin-1。(3)高效： 气相色谱的柱效（n

2、值）约为2000塔板/m，而高效液相色谱约为5000塔板/m以上；一根高效液相色谱柱可同时分离多达100种以上的组分。(4)高灵敏度： 由于在HPLC中使用高灵敏度的检测器，如紫外检测器的最小检测量可达10-9g，荧光检测器第三张，PPT共四十二页，创作于2022年6月可达10-11克；所需试样为微升级。HPLC与GC相比较的突出优点： 用GC法分析样品须先气化，目前已知的有机 物中，能直接采用GC法进行分析的仅占20%。 而HPLC法则不受此限制，尤其适合于分析生 物、医学方面的大分子及离子型化合物。 HPLC方法中，有两个相与样品分子相互作用 ，而GC方法中一般认为只有一个相与样品分 子相

3、互作用。所以HPLC的选择性大大提高。第四张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 HPLC方法中，因为在常温下进行分析，因此 固定相的选择比GC多；另一方面可提高色谱 的分离效率。 HPLC方法中，可使用灵敏度较高的光度检测 器，而在GC方法中则无法使用。 HPLC方法中，样品可以回收，而GC方法中样品 回收则较困难。10-2 HPLC色谱仪第五张，PPT共四十二页，创作于2022年6月高效液相色谱仪的结构如下： 由贮液瓶、高压泵(梯度洗提装置)、进样器、色谱柱(恒温器)、检测器和记录仪组成。第六张，PPT共四十二页，创作于2022年6月主要部件简述：1.高压泵 其作用是输送载液(流动相)

4、。由于色谱柱很细 (16mm)，填充剂粒度小(几十微米)，因此要 达到快速高效的分离效果，要求压力为150 200kg/cm2。2.梯度洗提装置 又称梯度洗脱(gradient elution)和气相色谱 法中的程序升温类似，对复杂混合物的分离带 来方便。第七张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 所谓梯度洗提，指载液中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变载液中各溶剂的配比。由此通过改变载液的极性来达到分离组分，提高分离效果。3.进样装置第八张，PPT共四十二页，创作于2022年6月因为流路中为高压力工作状态，通常使用耐高 压的六通阀进样装置。4.色谱柱 常用的

5、标准柱型是内径4.6或3.9mm，长度为1530cm的直形不锈钢管。填料粒度510m，柱效以理论塔板数计大约700010000。其发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。第九张，PPT共四十二页，创作于2022年6月5.检测器常用的检测器：(1)紫外光度检测器(UV)： 它的作用原理是基于被分析试样对特定波长紫外光的选择性吸收。池内样品浓度与吸收的光强度服从比耳定律。P.304. 最小检测量为10-9gmL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。第十张，PPT共四十二页，创作于2022年6月紫外检测器的缺点：不适用于紫外光完全不吸收的试样，溶剂的选用也受到一定的限制。 光电二极管阵列(

6、photo-diode array detector)检测器是紫外检测器的重要进展。1024个二极管阵列，各检测特定波长，通过计算机快速处理，形成三维立体谱图，如图所示。第十一张，PPT共四十二页，创作于2022年6月第十二张，PPT共四十二页，创作于2022年6月(2)差示折光检测器：偏转式差示折光检测器光路图 光源1射出光线由透镜2聚焦,透过遮光板4的狭缝,经反射镜5反射后,由透镜6汇聚两次,穿过工作池7和参比池8 该检测器是继UV检测器之后，第二种广泛使用的液相色谱检测器。图示：第十三张，PPT共四十二页，创作于2022年6月被平面反射镜9反射出来，成像于棱镜11的棱口上，光束均匀分为两

7、束，到达对称的光电管12上。 如果工作池和参比池皆通过纯流动相，光束无偏转，左右两个光电管的信号相等； 如果工作池中有试样通过，由于折射率改变，造成光束偏转，从而使到达棱镜的光束偏离棱口，左右两个光电管接受的光能量不等，其差值正比于试样的浓度。第十四张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 每种物质都有各自不同的折射率，因此都可用差示折光检测器进行检测，所以是一种通用型的浓度检测器。灵敏度为10-7gmL-1。 缺点：对温度变化很敏感，此检测器不能用于梯度洗提。3-3 HPLC的理论基础简述 高效液相色谱法的理论基础基本与气相色谱法相同，但有其不同之处。两者的主要区别在于流动相的不同。第十五

8、张，PPT共四十二页，创作于2022年6月根据速率理论，HPLC中影响柱效的因素如下：涡流扩散项He He=2dp 其含义与气相色谱法相同。第十六张，PPT共四十二页，创作于2022年6月2.纵向扩散项 Hd 式中Cd为常数，Dm为分子在流动相中的扩散系数。由于分子在液体中的扩散系数比在气体中小45个数量级，当流动相的线速度0.5cms-1，该项对H的影响可忽略不计。而GC中该项的影响则很大。3.传质阻力项 与GC类似， HPLC也可分为固定相传质阻力项和流动相传质阻力项。第十七张，PPT共四十二页，创作于2022年6月固定相传质阻力Hs主要发生在液液分配色谱中，类似于气液色谱中的液相传质阻力

9、项。 式中Cs 为常数(与k有关)；Ds为组分分子在固定液内的扩散系数；由上式可见，Hs与GC中的CL含义是一致的。 流动相传质阻力HPLC中该项有两种形式，分为在流动的流动相中和滞留的流动相中的传质阻力，分别用Hm和Hsm表示。第十八张，PPT共四十二页，创作于2022年6月式中Cm是常数(与k有关)，Dm 为组分分子在流动相中的扩散系数。式中Csm为一常数； 综上所述，由柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为：将上式简化： H= A + B/u + Cu第十九张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 可见，减小填料的孔径和粒度，采用低粘度及低流速流动相，适当提高温度等方法都可提高柱

10、效。 由Hdp2可知，其中减小填料粒度是提高柱效的最有效途径；因孔穴深度也同时随之减小。 总结：HPLC速率方程式形式与GC一致，其主要区别在于HPLC纵向扩散项(Hd )可以忽略不计，影响柱效的主要因素是涡流扩散项He和传质阻力项Hm、Hsm 、Hs。第二十张，PPT共四十二页，创作于2022年6月3-4 HPLC的主要类型及其分离原理根据分离机制的不同，HPLC可分为下述几种主要类型：第二十一张，PPT共四十二页，创作于2022年6月液-液色谱法、液-固色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法、离子色谱法和空间排阻色谱法等。1.液-液分配色谱法(L-L partition chromatogr

11、aph) 流动相和固定相都是液体，其分离原理为试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异。当浓度分配达到平衡时，应服从于下式：第二十二张，PPT共四十二页，创作于2022年6月液-液分配色谱主要有两种类型： 正相液-液分配色谱 用于分离极性较强的水溶性样品，非极性或弱 极性的物质不易被保留，出峰较早。 反相液-液分配色谱 用于分离水溶性较差的样品，出峰次序与正相 的相反，极性组分先被洗脱。特点：色谱柱制备的重现性较好；缺点： 分离过程中由于流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定液会不断流失而导致柱的保留行为变化。 第二十三张，PPT共四十二页，创作于2022年6月为此将各种有机基团通过化学反

12、应键合上担体表面，代替机械涂渍的液体固定相，如此可克服该方法的缺点。2.液-固色谱法(L-S adsorption chromatograph) 流动相为液体，固定相为吸附剂。根据物质对 组分分子吸附作用的不同来进行分离。该方法适用于分离脂溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象。第二十四张，PPT共四十二页，创作于2022年6月3.离子交换色谱法(ion-exchange chromatography) 该方法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中携带相同电荷的组分离子进行可逆交换，依据这些离子对交换剂的不同亲和力而进行分离。凡

13、是在溶剂中能电离的物质通常都可用离子交换色谱法进行分析。第二十五张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 离子交换色谱法主要用来分离离子或可离解的化合物，20世纪60年代前后，已成功分离了氨基酸、核酸、蛋白质等，在生物化学领域得到了广泛的应用。第二十六张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 空间排阻色谱法以凝胶(gel)为固定相。分离机理与其它色谱法完全不同。 该方法分离的机理类似分子筛的作用，但孔径比分子筛要大，为数纳米到数百纳米。溶质在两相间的分离不是由于相互作用力的不同，而是按分子大小进行分离。4.空间排阻色谱法(steric exclusion chromatograph)第二十

14、七张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 试样中的大分子不能进入胶孔而受到排阻，就直接通过柱子首先在色谱图上出现；另外一些小分子可以进入胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。第二十八张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 排阻色谱法中，载液分子通常都很小，它们一般最后被洗脱(tM最大)，结果是：整个试样都在tM(死时间)以前洗脱。 由于排阻色谱法的分离机理与其他色谱法不同，具有几个突出的特点：第二十九张，PPT共四十二页，创作于2022年6月(1)试样峰全部在溶剂的保留时间前出峰，它们 在柱内的停留时间短，故柱内产生的峰扩展 比其他方法小得多。(2)固定相

15、和流动相的选择简便。(3)适用于分离相对分子质量差别在10%以上的 分子。第三十张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 GC中可供选择的载气只有三四种，它们的性质差异不大。要提高柱的选择性，主要是改变固定相的性质。3-6 HPLC的流动相 而HPLC中，当固定相选定时，流动相的种类、配比能显著地影响分离效果。选择流动相时应注意以下几方面因素：纯度 如溶剂不纯，则长期积累杂质会导致检测器噪声增加，同时也影响收集的馏分纯度。第三十一张，PPT共四十二页，创作于2022年6月(2)避免使用引起柱效损失或保留特性变化的溶 剂。(3)对试样要有适宜的溶解度，否则在柱头易产 生沉淀。(4)考虑到泵压，

16、流动相的粘度小些为好。(5)应与检测器相匹配，如紫外光检测器，就不 能使用对紫外光吸收的溶剂。第三十二张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 常用溶剂的极性顺序排列如下：水(极性最大)、甲酰胺、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、正丁醇、醋酸乙酯、乙醚、异丙醚、氯仿、苯、甲苯、四氯化碳、二硫化碳、环己烷、煤油(极性最小)。 溶剂还可采用二元或多元组合。根据分别所起的作用，采用的溶剂可分成底剂及洗脱剂两种。 底剂决定基本的色谱分离情况；洗脱剂则起调节试样组分的滞留并对某几个组分具有选择性的分离作用。第三十三张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 正相色谱中，底剂采用低极性溶剂如正己烷、苯、

17、氯仿等；而洗脱剂则根据试样的性质选取极性较强的针对性溶剂如醚、酯、酮、醇和酸等。 反相色谱中，底剂一般采用水，洗脱剂常采用有机溶剂如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。 而离子交换色谱法主要在含水介质中进行，组分的保留值可通过调节流动相中的离子强度和pH来控制。第三十四张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 排阻色谱所用的溶剂必须与凝胶本身非常相近，以润湿凝胶并防止吸附作用。对分离大分子化合物，易采用粘度小的溶剂作流动相如四氢呋喃、甲苯等。对分离生物物质，主要采用水、缓冲盐溶液等。3-7 HPLC分离类型的选择 应用HPLC对试样进行分离、分析方法的选择，应考虑几种因素，包括：试样性质(分子量、结构、

18、极性、溶解度等)、HPLC分离方法类型的特点及应用范围等。第三十五张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 如果分子量较低，挥发性较高且热稳定的试样，适用于GC法进行测定。HPLC法适用于相对分子质量为200到2000的试样测定，大于2000的宜用空间排阻色谱。 另外，了解试样在多种溶剂中的溶解情况，有利于分离类型的选择。 如溶解于水的试样可采用液液色谱法；溶解于酸或碱性水溶液的，则表示试样为离子型化合物，可采用离子交换色谱法、离子对色谱法等。第三十六张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 而异构体的分离，则采用吸附色谱；空间排阻色谱可适用于水或非水溶液，且分子大小要有差别的试样。下表为液相色谱法分离类型选择参考表：P.299 对非水溶性试样(很多有机物属此类)，若溶于烃类，可选用液固吸附色谱；若溶于二氯甲烷或氯仿，可选用液液正相色谱；若溶于甲醇的，可用液液反相色谱。