高效液相色谱分析 (7)PPT

1、关于高效液相色谱分析 (7)1第一张，PPT共六十页，创作于2022年6月17.1 概述17.2 HPLC仪器 包括：高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统17.3 流动相和固定相简介17.4 高效液相色谱方法各论 分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱第二张，PPT共六十页，创作于2022年6月17.1 概述 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在

2、直径15cm, 长50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150200m范围内。即使这样，流速仍然很低(7时，该检测器不够灵敏。其它检测器还包括：MS、IR、Evaporative light scattering detector(光散射)、极谱等。第十八张，PPT共六十页，创作于2022年6月17.3 HPLC流动相和固定相简介一、固定相载体 由于各种HPLC分离方法的流动相均为液体，因此，HPLC通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。1. 按承受压力分刚性固体：SiO2为基质，耐压为7.01081.0109 Pa。可制成直径、形状和孔隙深度不同

3、的颗粒；主要用于吸附、分配和键合色谱；硬 胶：以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成)，耐压上限为3.5 108 Pa, 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。第十九张，PPT共六十页，创作于2022年6月2. 按孔隙深度分表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分析。全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、传质快、 柱效高。特别适于复杂混合物的分离。第二十张，PPT共六十页，创作于2022年6月

4、二、流动相 与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样，参与对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。 液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 第二十一张，PPT共六十页，创作于2022年6月2 溶剂的特性参数主要包括溶剂强度参数、溶解度参数和极性参数等，具体见P357表17.21 对流动相的要求1）对

5、待测物具一定极性和选择性；2）使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长(为什么？) ；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别；3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；4）化学稳定性好；5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。第二十二张，PPT共六十页，创作于2022年6月1）、溶剂强度 在吸附色谱中，通常固定相是极性的硅胶或氧化铝，而溶剂是非极性的，或含有极性溶剂的混合溶剂。采用溶剂强度0将溶剂排队，一般定义正戊烷的0为零，其它的见表。0越大-溶剂极性越大-k越小。2）、溶解度参数 在分配色谱中（例如为反相色谱），固定相是非极性的，溶剂是

6、极性的，溶剂的作用更大，溶剂强度与溶剂的极性成反比。 溶解度参数更好地代表溶剂的极性。溶解度参数由四个部分组成 =d + 0 + a + h第二十三张，PPT共六十页，创作于2022年6月其中： d - -色散力 o-偶极矩 a , h -质子给予、接受的一种量度3)、选择性参数 P= log(Kg)e+log(Kg)d+log(Kg)n P-极性参数 Kg-与溶剂汽化自由能成比例的极性分布系数。它分别根据乙醇（e）二噁烷（d）和硝基甲烷（n）中的数据计算。第二十四张，PPT共六十页，创作于2022年6月选择性参数 xe= log(Kg)e/P xd = log(Kg)d/P xn = log

7、(Kg)n/P 根据溶剂强度和极性参数分类、排队，只代表k值，对于难分离物质对，要根据溶质与溶剂之间的特殊作用才能分离。 每种溶剂可以得到xe、xd、和xn三个数据，根据数值在三角形平面坐标上找所在位置。位置不同分成八个区域，每个区域的溶剂有类似的性质。见P359图17.11第二十五张，PPT共六十页，创作于2022年6月3、流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇

8、丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)第二十六张，PPT共六十页，创作于2022年6月17.4 高效液相色谱方法各论 按分离原理可将HPLC分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。现在作分别介绍。一、分配色谱 原理： 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。2. 流动相: HPLC分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极

9、性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。第二十七张，PPT共六十页，创作于2022年6月正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系第二十八张，PPT共六十页，创作于2022年6月3. 固定相 原则上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：,-氧二丙腈(O

10、DPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撑二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鲨烷(SQ)。 根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。1）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。 为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。第二十九张，PPT共六十页，创作于2022年6月2）化学键合固定相 化学键合固定

11、相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。 通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）。第三十张，PPT共六十页，创作于2022年6月二、化学键合相色谱法（CBPC） 采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种

12、类繁多样品的分离。1键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类（1）疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等（2）极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐,作为阳离子交换 基团的磺酸等。第三十一张，PPT共六十页，创作于2022年6月时间，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长

13、，分离效果越好。第三十二张，PPT共六十页，创作于2022年6月2键合固定相的制备（1）硅酸酯（Si一OR）键合固定相,它是最先用于液相色谱的键合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应： SiOHROHSiORH20 由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。第三十三张，PPT共六十页，创作于2022年6月 共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在48范围内。（2）SiC或Si一N共价 键合固定相，制备反应： 第三十四张，PPT共六十页，创作于202

14、2年6月（3）硅烷化（SiOSiC）键合固定相制备反应： 这类键合固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70以下，pH=28范围内正常工作，应用较广泛. 第三十五张，PPT共六十页，创作于2022年6月3. 正相和反相键合色谱法第三十六张，PPT共六十页，创作于2022年6月4.离子型键合相色谱法 当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一SO3H 一CH2NH2、COOH、一CH2N(CH3) Cl等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。 第三十七张，PPT共六十页，创作于2022年6月三、液一固吸附

15、色谱法(LSAC) 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。1分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附: X + nSad = Xad + nS第三十八张，PPT共六十页，创作于2022年6月达平衡时,有 其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值

16、弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通过吸附等温线数据求出。 第三十九张，PPT共六十页，创作于2022年6月2固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。 在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。第四十张，PPT共六十页，创作于2022年6月3、流动相 一般把吸附色谱中流动相称作洗

17、脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ 0 ）来衡量。 0越大，表示洗脱剂的极性越强。表17-4列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的0值。在硅胶吸附剂中0值的顺序相同，数值可换算（0硅胶=0770氧化铝）。 第四十一张，PPT共六十页，创作于2022年6月(四）离子交换色谱法（IEC） 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等

18、生物大分子。因此，应用范围较广。 第四十二张，PPT共六十页，创作于2022年6月1离子交换原理 离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换： 阴离子交换： 一般形式： R一AB RBA第四十三张，PPT共六十页，创作于2022年6月达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）： 式中Ar，Br 分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，A、B则代表它们在溶液中的浓度。离子交

19、换反应的选择性系数见从表示试样离子B对于A型树脂亲和力的大小：KB/A越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，B离子电荷越大，水合离子半径越小，KB/A值就越大。第四十四张，PPT共六十页，创作于2022年6月 对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以下顺序：Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二价离子的顺序为：Ba 2+Pb 2+Sr 2+Ca 2+Cd 2+Cu 2+，Zn 2+Mg 2+对于季胺型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为： ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH- HCO3-H2P04-IO3-C

20、H3COOF2固定相 作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分第四十五张，PPT共六十页，创作于2022年6月按离子交换剂类型分四种： 按固定相制作方法可分为： 多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型)； 表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂； 离子交换键合型。第四十六张，PPT共六十页，创作于2022年6月1）多孔型： 聚苯乙烯+二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。2）表面多孔型： 薄膜型=惰性核+树脂薄层(1-2m)

21、多孔型=惰性核+硅胶微球+树脂薄层。 克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。3）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。微孔型 大孔型微孔微孔薄膜型 表面多孔型离子交换层惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆第四十七张，PPT共六十页，创作于2022年6月3. 流动相 离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定pH和离子强度) ，通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。pH值：影响酸

22、或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度I：对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对R+或R-的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子L：当大量L、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：RM-L+X RM-X+L该法用于分离各种氨基

23、酸或碱类。第四十八张，PPT共六十页，创作于2022年6月五、离子色谱法（IC） 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。 为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离

24、往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：第四十九张，PPT共六十页，创作于2022年6月 R+OH-H+Cl- R+Cl十H2O R+一OH-M+Cl-M+OHR+Cl- 由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度为Cl-离子的26倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。 该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液(如苯甲酸盐稀溶液)作流动相。 在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦

25、称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。后来，Frits等人提出采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导率极低的溶液，例如110-4510-4moldm-3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。第五十张，PPT共六十页，创作于2022年6月六、离子对色谱法（IPC） 离子对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱。1. 原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相（常为有机相）中，使待测离子A与对离子B形成离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变

26、了待测离子的保留特性。例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子A-有相反电荷的离子B+： 由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子A1，A2，A3.因与B离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。第五十一张，PPT共六十页，创作于2022年6月2键合相反相离子对色谱法 离子对色谱法类型很多，根据流动相和固定相的极性可分为反相离子对和正相离于对色谱法。其中以键合反相离子对色谱法最重要。这种色谱法的固定相采用非极性的疏水键合相如十八烷基键合相（ODS）等，流动相为加有平衡离子（反离子）的极性

27、溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。 根据离子对生成反应式，平衡常数 KAB可表示为 根据定义，溶质的分配系数 第五十二张，PPT共六十页，创作于2022年6月根据上两式，有式中为相比率。容量因子k随KAB和B+水相的增大而增大。 键合相反相离子对色谱法操作简便，只要改变流动相的pH值、平衡离子的浓度和种类，就可在较大范围内改变分离的选择性，能较好解决难分离混合物的分离问题。此法发展迅速，应用较广泛.第五十三张，PPT共六十页，创作于2022年6月（七）尺寸排阻色谱法（SEC）尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分析，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：(1) 保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。(2) 保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器(3) 固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。(4) 不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10才能得以分离。第五十四张，PPT共六十页，