蛋白质的提纯-分离课件

1、生物大分子的分离纯化LOGO背景生物分子生物分子（biomolecle）：泛指生物体特有的各种分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命的基本单位。 小分子（如脂类 激素 维生素等）包括 大分子（蛋白质 核酸 糖复合物等）生物大分子是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子 背景在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究成为探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有达到足够纯度的生物大分子，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工

2、作。 背景 与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点： 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。 从动物肝组织中分离 提取 纯化 鉴定一种酶从生物样品中分离提纯生物大分子一般常用的技术路线和设计方案。选择材料和预处理细胞的破碎及细胞器的分离提取和纯化浓缩

3、干燥 保存对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。本实验中，应先将新鲜的肝脏冷冻23h，提出脂肪和结缔组织，切成小块以备后用。细胞的破碎机械破碎高速组织捣碎 玻璃匀浆器匀浆物理破碎超声波处理法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎取肝脏样品，加入提取液，

4、依据所提取酶的不同，还可加入不同的试剂，以起到保护蛋白质或增加蛋白质可溶度的作用。常用的试剂有：酚类结合剂PVPP，金属螯合剂 Na2EDTA，以及SH化合物以保护蛋白质，或加入非离子型去垢剂如Triton X100，以增加蛋白质的可溶度，可用于与膜脂结合的酶。提取和纯化通常在做纯化前对自己的目标物质特性了解越多对纯化将会越有利，如果不太了解，也可以通过电泳知道目标物质和杂质的情况 ，找到一种简单的鉴定方法，此外在纯化前必须先建立可靠的活性测定的方法。 如果是未知的蛋白，那么通常可以有几种简单的摸索： 1.凝胶过滤色谱 这个方法很常用，但是效率不高，对低浓度的样品没有富集作用，上样量小。 2.

5、离子交换色谱 此法也很常用，但是样品必须没有高浓度的盐。 3.疏水色谱 此法较好，它分离效率高，上样量大，特别适合分离盐析沉淀的样品。 4.亲和色谱 是最有效的手段，关键了解目标物质的特性以便 选择合适的亲和色谱填料。 如果知道蛋白质的特性，则可以依据蛋白质的性质对其进行分离，常用的方法有： 等电点沉淀法 ：蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。低温有机溶剂沉淀法 ：用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高

6、，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低 超滤原理的示意图 凝胶过滤法 ：也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（agarose gel） 依据蛋白质带点性质不同电泳法：种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。 离子交换层析法 ：离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE等，）当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。 浓缩 干燥 保存一 样品的浓缩 ： 1、减压加温蒸发浓缩 2、空气流动蒸发浓缩 3、冰冻法 4、吸收法 5、超滤法 二、干燥：常用的方法是冷冻干燥和真空干燥三、贮