基因工程以及在医药上的应用81课件

1、基因工程及其在医药学中的应用 重组DNA技术DNA Recombination Technique 基因工程相关概念基因工程相关的酶学基因工程的载体目的基因的制备和分离方法载体与目的基因的连接重组体的鉴定与分析隆基因的表达本章主要内容重组DNA技术的发展史年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年 英国罗林研究所成

2、功的克隆了多莉一、重组DNA技术相关概念 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。（一）DNA克隆2.克隆化(cloning) 细胞的分化潜能 全能性(totipotency)一个细胞在一定条件下具有发育成完整个体的潜能，称为细胞的全能性(totipotency)。具有这种潜能的细胞称为全能性细胞。细胞核全能性 DNA克隆目的: 分离获得某一感兴趣的基因或DNA; 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）。重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA cDNA人工合成PCR产物限制酶消化开

3、环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目 录1.限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE)(1) 定义识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统：限制外源DNA，保护自身DNA，稳定细菌遗传性状。(2) 分类、作用、（基因工程技术中常用型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。(3

4、)命名EcoR 属 种 株 序Escherichia coli RY13株大肠杆菌 RY13株的第一种酶(4)类酶识别序列特点 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口 同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA

5、序列分析填补3末端2. DNA聚合酶3.TaqDNA聚合酶 (TagDNA polymerase) 是一种耐热的依赖于DNA的D NA聚合酶，具有聚合酶活性，该酶最适反应温度为75 80 (1)具有完整DNA聚合酶I的53聚合、 35外切活性，而无53外切活性.。 常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3 末端标记等.5. Klenow片段6. DNA连接酶 (DNA ligase)功能:催化DNA中相邻的5磷 酸基和3羟基末端之间形成 磷酸二酯键，使DNA切口封 合或使两个DNA分子或片段 连接.功能:催化多聚核苷酸5羟基 末端磷酸化，或标记探针.7. 多聚核苷酸激酶功能: 在3羟基末端进行

6、种核 苷酸多聚物加尾8.末端转移酶（三）目的基因 cDNA (complementary DNA)基因组DNA (genomic DNA)功能:切除5末端磷酸基团9.碱性磷酸酶 （三）基因载体 (cloning vector)1.概念：携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。来源分类：质粒载体噬菌体载体病毒载体人工染色体载体用途分类：克隆载体表达载体 穿梭载体2. 常用载体:克隆载体(cloning vector)能使插入的外源DNA序列被复制、扩增而不能表达，这样的载体为克隆载体。表达载体(expression vector) 使插入的外源DNA序列转录翻译，

7、表达出多肽链，这样的载体称为表达载体。这类载体中含有来源不同的复制子结构，即具备原核细胞复制所需的序列结构，又具有能使外源片段在真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择标记基因,所以能在两种受体细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种受体中进行复制和表达穿梭载体（shuttle vector)3.载体具备以下条件:1.具有自我复制能力具有多个单一限制性酶切位点具有选择性遗传标记分子量小，拷贝数高具有较高的遗传稳定性 松弛型的复制子、多克隆位点、 筛选标记. 常见:质粒、噬菌体克隆载体必需结构:具有复制子，筛选标记，位于多克隆位点的上下游具有转录效率较高的启动子，起始密码

8、子和核糖体结合位点，转录终止子结构表达载体结构特点： 概念: 存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环的DNA分子。质粒 (plasmid)分子量相对较小，能在细菌内稳定存在能在宿主细胞内独立自主复制具有某些遗传标志, 会赋予宿主细胞一些 遗传性状；具有多个限制酶的单一位点（多克隆位点） 质粒特点:细菌质粒质粒的复制类型严谨型（strigent plasmid)：复制与宿主染色体同步受宿主染色体复制的限制，在宿主细胞中拷贝数低约份拷贝松弛型（relaxed plasmid):复制不受宿主染色体复制的限制可独立复制，在宿主细胞中拷贝数高基因工程常用载体常用质粒载体种类：pBR322pUCpBR3

9、22:人工构建重要质粒优点：具有较小的分子量具有两种抗生素抗性基因，可作为筛选标记具有高拷贝数是松弛型质粒目 录pUC质粒特点：来源于pBR322质粒的复制起始点具有两种抗生素抗性基因，但基因内无核酸内切酶位点含有大肠杆菌半乳糖苷酶-肽段编码基因统称LacZ基因靠近LacZ基因端有一段多克隆位点，影响LacZ基因功能含有一个调节 LacZ基因表达的阻遏蛋白基因LacIpUC质粒优点：具有更小的分子，更高的拷数适于组织化学检测重组体噬菌体(phage) 噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）噬菌体(phage)载体系统分类： M13噬菌体

10、DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列左臂右臂非必需序列重组分子左臂右臂不能包装的病毒颗粒左臂右臂插入单一酶切位点或一对内切酶位点噬菌体DNA改造系统左臂右臂粘性质粒(cosmid)结合质粒克隆载体和噬菌体克隆载体的优点结构：质粒DNA接上噬菌体 粘性末端(cos).粘性质粒(cosmid)：具有噬菌体 粘性末端特性具有质粒耐药性标记具有多个限制性酶切位点具有高容量的克隆能力接上真核细胞复制子和启动子及选择标记，就能在真核细胞中存在和表达粘性质粒的特点酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)细菌人工染色体 (bacterial ar

11、tificial chromosome, BAC)动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其它（四）目的基因 cDNA (complementary DNA)基因组DNA (genomic DNA)（一）目的基因的获取1. 化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3. cDNA文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)（见第22章） 化学合成获取目的基因* 化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序

12、列分 子 文 库基因组DNA文库获取目的基因(genomic DNA library)组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合* 从基因组DNA文库获取目的基因目 录EcoR IGenomic LibraryInfect cells限制酶切位点限制酶消化 除去中间片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 K

13、b 外源 DNA 片段 基因文库目 录cDNA文库获取目的基因(cDNA library)mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制* 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶碱水解 T T T T目 录引物cDNA 文 库基于核酸杂交的筛选;基于抗原抗体反应的筛选。在文库中筛选目的基因原理 聚合酶链反应获取(polymerase chain reaction, PCR)5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 55

14、5 5 55PCR基本工作原理目 录Cycle 35 5555 5 555 5 55 555 52530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目 录 PCR的基本反应步骤变性95C延伸72C退火Tm-5C模板DNA 特异性引物耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ PCR体系基本组成成分（五）目的基因与载体的连接经限制酶作用于目的基因与载体DNA，在连接酶催化下，来源不同双链DNA片段，断端重新形成，磷酸二酯键的过程连接原理粘性末端连接平端连接一端粘性末端与另一端平端连接连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接粘性末端连接Ba

15、m H切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割载体DNA用Bam H切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接目 录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点Bg l切割位点+EcoR+ Bg l双酶切Eco R+ Bg l双酶切T4 DNA连接酶15C重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目 录定向克隆适用于：限制性内切酶切割产生的平端或粘端补齐或切平形成的平端T4 DNA连接酶催化平端连接 平端连接目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶15C重组体载体自连目的基因 自

16、连目 录在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。同聚物加尾连接5335载体DNA5335目的基因限制酶或机械剪切限制酶 53 5 T(T)nT T(T)nT 5 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端转移酶+ dATP末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶15C重组体目 录由平端加上新的含有限制性酶切位点的接头，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头(linker)连接人工接头及其应用CCGAA

17、TTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目 录（六）重组DNA导入受体菌受体菌条件：安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷受体菌处于感受态(competent) 感受态(competent) : 指细胞在一定的生理状态可摄取外源性遗传物质经体内重组成为染色体中的一部分,导致受体细胞某些遗传性状的改变.经人工处理能吸收重组DNA分子敏感状态的宿主细胞，称之为人工感受态细胞导入方式：转化 (transformation)转染 (transfection)感染 (infection)转化 (transformation)： 以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过

18、程.转染 (transfection): 以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子导入真核细胞的过程.感染 (infection):以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子,经体外包装成具有感染性噬菌体或病毒颗粒后,借助于噬菌体或病毒的蛋白外壳将重组DNA分子注入细菌或真菌细胞,从而使目的基因得以复制的过程.（七）重组体的筛选(1) 抗药性标记选择(2) 标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法原位杂交Southern印迹1. 直接选择法 2. 免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等.限制性内切酶图谱.双脱氧终止法测序（sanger法）目 录(插入失活法)抗药性标记选择

19、组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成DNA重组体标志补救目 录 互补的检测目 录原位杂交目 录核酸杂交Southern印迹目 录鸡的肌球蛋白的克隆和检出目 录重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA cDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目 录 以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结分分离目的基因 切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体 转转入受体菌 筛筛选重组体 （八

20、）克隆基因的表达将外源目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞的过程称为外源基因的表达外源基因的表达外源基因的表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程，表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化外源基因的表达步骤外源基因在原核细胞中的表达原核表达系统就是将克隆的外源基因导入原核细胞，使其在细胞内快速、高效地表达基因产物，主要有大肠杆菌、芽孢杆菌及链霉菌系统等 E.coli表达体系最为常用组成：选择标志强启动子翻译调控序列多接头克隆位点原核表达体系表达载体pFASTBACI 的物理图谱不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵

21、体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白E.coli表达体系的不足 外源基因在原核细胞中的表达1融合型表达蛋白 所谓融合型表达是指将外源目的基因与宿主结构基因相拼接构建成融合基因进行表达这样产生的蛋白质的N末端为宿主基因序列（可以是原核DNA或其它DNA序列）编码，C末端由外源目的基因编码。 2非融合型表达蛋白 是指外源目的基因不与宿主基因融合，直接从起始密码AUG开始在原核调控元件控制之下表达外源基因蛋白质。 非融合型表达的蛋白质具有类似天然蛋白质的结构，其生物学功能也更接近于体内的天然蛋白质。但其缺点是容易被细菌蛋白酶降解。3分泌型表达蛋白 分泌型表达是利用具有信号肽编

22、码序列的分泌型表达载体，将表达的蛋白质由细胞质跨膜分泌到细胞基质或细胞周质中。 强启动子及其调控序列、 SD序列 SD序列下游携带有一段信号肽序列。 常用的信号肽有OmpA、PelB、PhoA 和Hly等。分泌型表达载体组成:需注意是，不同蛋白质的分泌需要不同的信号肽， 大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌目 录外源基因在真核表达克隆基因含有:原核克隆载体的复制子 抗性筛选基因 限制性内切酶酶切位点序列， 真核表达载体真核表达载体大多是穿梭载体. 表达基因 真核细胞的启动子、增强子、 剪接信号、转录终止信号 PolyA化信号 遗传选择标记等组件，真核表达体系：酵母、昆虫、乳类动物细胞真核表达体系优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰,表达的蛋白质表达产物分区域积累真核细胞具有翻译后加工系 统，可进行糖基化、磷酸化、 乙酰化等修饰，使表达蛋白 形成正确的天然构象，具有 完整的生物学活性。某些真核细胞可将外源基因表达产物 直接分泌至细胞培养基中，简化了分 离纯化的操作。真核表达体系