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文档简介
1、量子点纳米晶制备及其在生物分析中应用第1页第1页量子点 (Quantum dots)有时也叫纳米晶,它是纳米尺度原子和分子集合体,普通粒径范围在220nm。量子点即是将材料尺寸在三维空间进行约束,并达到一定临界尺寸(抽象成一个点)后,材料行为将含有量子特性(类似在箱中运动粒子),结构和性质也随之发生从宏观到微观转变。量子点纳米晶生物医学第2页第2页Quantum Dots ( QDs) 量子点 (Luminescence Semiconductor nanocrystals 半导体纳米晶体 ) 70 年代,量子点由于其独特光学特性,认为其应用主要集中在电子与光学方面 80 年代,生物学家已经对
2、量子点产生了浓厚兴趣,但由于它荧光量子产率低,工作集中在研究量子点基本特性方面 1997 年以来,量子点制备技术不断提升, 量子点已越来越也许应用于生物学研究。 量子点可作为生物探针是从1998年美国加州伯克利大学Alivisatos 印第安纳大学Nie两个研究小组开始,此后量子点功效进一步被发觉、推广,使之成为生物学领域研究热点。第3页第3页纳米粒子和生物分子尺寸范围第4页第4页生物标识技术(Biomarker)生物标识技术原理是将含有标志性信号材料,如不同颜色染料分子,能发射强荧光分子,含有磁性或放射性分子等,经过化学键或非共价键和待识别生物组织连接起来,从而直观地观测和分析被标识物存在和
3、改变。第5页第5页当前有3种类型纳米粒子可做为荧光标识1)含有光学活性金属纳米粒子2)荧光纳米球乳液(已商品化)3)发光量子点第6页第6页长径比不同Au 纳米棒TEM 照片(上方),光谱(左下角)和照片(右下角)(a)1.35 0.32;(b) 1.95 0.34;(c) 3.06 0.28;(d) 3.50 0.29;(e) 4.42 0.23第7页第7页光镜金银免疫金银染色标识细胞表面标志物观测结果(a)Siha 细胞中HPV16病毒位置,HPV16病毒是子宫颈癌标志物(b)锋利湿疣细胞中HPV6/11病毒,由于病毒被大量感染,细胞被染成深色免疫金纳米粒子细胞染色第8页第8页普通胶体金标识
4、 免疫胶体金标识免疫金纳米粒子细胞染色电镜下观测到细胞纺锤形微管第9页第9页量子点在生物分析中应用 荧光分析法惯用于临床测定生物样品中一些成份含量,但若直接用荧光光谱法对它们进行研究时,碱基和核酸荧光量子效率很低,只有色氨酸、酪氨酸、和苯丙氨酸有天然荧光,因此检测它们最好办法还是利用各种荧光探针。 当前,应用最为普遍荧光探针是有机染料,但它们激光光谱都较窄,因此难同时激发各种组分,而其荧光特性谱又较宽,并且分布不对称,最严重缺点是其光化学稳定性差。第10页第10页研究较多量子点主要由II-VI族或III-V 族元素构成第11页第11页(a) CdSe 量子点发光和粒径关系;(b) CdSexT
5、e1-x 发光和构成关系(粒径保持不变,5 nm)第12页第12页单个波长可激发全部量子点,而不同染料分子荧光探针需多个激发波长应用范围广:可用于多领域和多仪器各种颜色:颜色取决于量子点大小,在同一激发波长下,可发出各种激发光,达到同时检测各种指标要求。抗光致漂白性安全:细胞毒性低,可用于活细胞及体内研究荧光时间长:荧光时间较普通荧光分子长数千倍,便于长久跟踪和保留结果第13页第13页(a) 荧光素激发谱和发射谱(b) CdSe量子点激发谱和发射谱第14页第14页三种不同尺寸量子点荧光光谱第15页第15页荧光素和量子点标识物光稳性比较第16页第16页 与传统荧光探针相比,量子点激发光谱宽,且连
6、续分布,即不同大小纳米晶体能被单一波长光激发而发出不同颜色光,而发射光谱成对称分布且宽度窄,而且光化学稳定性高,不易光解 。 量子点作为一个荧光探针在生物标识及诊疗领域有着广泛应用前景。(Nature , , 413 : 450-452)Absorption and emission spectra of a series of size-selected CdSe nanocrystals. (Nature Biotechnology , , 19 : 621622)第17页第17页量子点标识过程示意第18页第18页量子点合成1 有机体系2 水相体系第19页第19页 有机金属前驱体溶液烷基金
7、属(如,二甲基镉)和烷基非金属(如,二-三甲硅烷基硒)主配体三辛基氧化磷(TOPO)及溶剂兼次配体三辛基磷Schematic procedure for the preparation of high quality nanocrystals via organometallic routes. (J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 8706)有机金属法第20页第20页量子效率高 (可达 90 %)荧光半峰宽窄 (仅有 30 nm) 是当前合成高质量量子点最成功办法之一反应条件过于苛刻,严格无氧无水操作原料价格昂贵,毒性太大,且易燃易爆优缺点第21页第21页有机“绿色化学
8、”法改进有机金属法 选取毒性小金属氧化物(CdO)或盐(Cd(OOCCH3)2,CdCO3) 选取长烷基链酸、氨、磷酸、氧化磷为配体; 以高沸点有机溶剂为介质减少了成本和对设备要求减少了对环境污染Chem. Eur. , 8, 334.第22页第22页 大多数生物分子都是亲水,有机相中纳米晶必须通过进一步表面亲水修饰才干具备生物亲合性,亲水修饰过程不但需要复杂表面配体互换,并且会破坏量子点发光性质。1 有机体系2 水相体系第23页第23页J. Phys. Chem. B , 106, 7177.离子型前驱体,巯基小分子配体介质为水第24页第24页通过回流使纳米晶逐步成核生长,由于水沸腾温度为
9、100,纳米晶没有明确生长界线造成量子点荧光半峰宽较宽,量子效率也较低,(仅有 310%)离心分级 (选择性沉淀) 来提升其量子效率第25页第25页水热法制备 CdTe 纳米晶为在水溶液中直接设计合成高质量纳米晶开辟了新路径高温加快了纳米晶生长速率和荧光半峰宽窄化 (黄绿光量子效率可达30以上) Adv. Mater., , 15(20), 1712, Hao Zhang & Bai Yang et al.第26页第26页第27页第27页未经任何处理即可用于生物标识鼠细胞平均尺度为4 m.标识有CdTe纳米晶鼠细胞荧光显微镜照片 (a) 细胞本身; (b) 发黄色CdTe纳米晶. 放大图象:
10、(c) 发绿色CdTe纳米晶;(d)发红色CdTe纳米晶. 第28页第28页荧光量子点表面修饰表面效应是影响纳米粒子性质一个不可忽略原因水溶性是纳米晶用于生物标识必须处理 第29页第29页量子点表面修饰树枝状分子配体修饰量子点第30页第30页用量子点检测肿瘤细胞Quantum dots modified with antibodies to human prostate specific membrane antigen light up murine tumors that developed from human prostate cells.第31页第31页用量子点检测肿瘤细胞 科学家们
11、将转铁蛋白与量子点共价交联, 让宫颈癌细胞“吞”进细胞内, 使连接了量子点转铁蛋白仍然含有生物活性,实现单色长期荧光标识观测。第32页第32页 他们采取两种大小不同量子点标识小鼠成纤维细胞, 一个发射绿色荧光, 一个发射红色荧光, 而且将发射红色荧光量子点特异地标识在细胞内肌动蛋白丝上, 而发射绿光量子点与尿素和乙酸结合, 这么量子点与细胞核含有高亲和力, 并且能够同时在细胞中观测到红色和绿色荧光,从而实现双色荧光标识观测。 第33页第33页在生物检测中其它应用把量子点分别同生物素、尿素、醋酸盐和某种抗体链接了起来,成功到达了特定细胞结构; 能够有许各种分子用作量子点导引物质,包括核酸、细胞膜
12、上脂质、同载体蛋白质或载体糖联系紧密蛋白质,尚有一些药物能够把量子点导引到特定细胞结构中去;研究人员正致力于量子点在神经递质研究(理解神经信号传导研究)中应用。他们将量子点标识在一个主要神经递质5-羟色胺上, 然后观测了转运蛋白是如何推动神经递质在将信号通过相邻神经细胞间隙传递后,又回到细胞中过程;能够应用在医学成像技术中 第34页第34页量子点与蛋白偶联 伴随人类基因组计划(HGP)顺利完毕,蛋白质组研究已经成为生命科学一个主要领域. 需要建立一些快速、高效、高通量蛋白质分析办法.量子点荧光探针在一些方面能满足这些要求。第35页第35页Willard等人将巯基乙酸修饰量子点与生物素标识牛血清
13、白蛋白(QD-bBSA)结合后,使之与四甲基罗丹明标识亲和素(Sav-TMR) 作用,结果观测到量子点与四甲基罗丹明(TMR)之间有荧光共振能量转移现象发生。Science 1998, 281:-. 这一结果表明,量子点可在蛋白质-蛋白质键合分析中作为荧光共振能量转移供体. 另外,将量子点与蛋白质芯片技术相结合,可大大提升蛋白质芯片检测灵敏度。第36页第36页量子点在其它方面应用Schematic representation of qdot targeting. Applied Biological Sciences , , 99 (20) : 12617 - 12621. 量子点用于活体方
14、面研究 将不同CdSe/ZnS核-壳型量子点表面用不同多肽修饰后,注射到老鼠体内,对活体切片后进行分析. 结果发觉:不同多肽修饰量子点可特异性结合到正常或发生肿瘤老鼠肺部脉管系统。 这些结果预示着量子点也许进行疾病诊断和药物传递等方面研究.第37页第37页 量子点在基因组学、蛋白质组学、药物筛选以及细胞成像等方面有着广泛应用前景,将量子点用于活体实时、动态检测是当前一个发展方向. 另外,应用多色量子点发展平行生物传感和检测技术也是当前一个发展热点,这些技术将把微流控技术、微阵列技术及量子点长处集中起来,有着辽阔发展前景.展望第38页第38页磁性纳米材料及其在生物医学中应用第39页第39页天然磁
15、性纳米材料许多生物体内就有天然纳米磁性粒子,如磁性细菌,鸽子,海豚,石鳖,蜜蜂,人大脑等这里有大量课题需要研究,尤其需要有物理和磁学背景人员参与,有助于对问题理解第40页第40页向磁性细菌1975年即发觉向磁性细菌-体内有一排磁性纳米粒子第41页第41页人类大脑中平均含有20微克(约500万粒)磁性纳米粒子第42页第42页石鳖齿舌中含有大量一维纳米磁性丝第43页第43页从各种细菌中分离得到磁性氧化铁纳米粒子粒径均一、形貌规整。当前纳米磁性材料制备主要依赖于化学制备办法。 第44页第44页磁性纳米材料通常为氧化铁所构成,如Fe2O3、Fe3O4现行产品中,常见利用包埋或包覆磁性微粒,结合抗体以做
16、为细胞分离与纯化环节第45页第45页磁性纳米材料合成取Fe2+与Fe3+混合加热,反应沉淀而得混合Fe3+及Fe2+在碱性条件下可形成Fe3O4纳米微粒第46页第46页磁性纳米粒子表面修饰较高比表面积,因此含有强烈汇集倾向调整磁性纳米粒子与其它材料相容性和反应特性采用有机小分子修饰粒子表面采用有机高分子修饰粒子表面采用二氧化硅修饰粒子表面第47页第47页磁性纳米粒子有机高分子修饰用多肽稳定-Fe2O3纳米粒子胶团示意图第48页第48页磁性纳米粒子表面SiO2修饰能够屏蔽磁性纳米粒子之间偶极互相作用,制止粒子发生团聚含有优良生物相容性、亲水性、稳定性采用水解有机硅氧烷办法制备尺寸均一SiO2微球
17、技术已相称成熟,为制备高质量磁性微球提供确保第49页第49页磁性纳米粒子表面SiO2修饰修饰SiO2核壳形磁性纳米微球,表面接有功效性基团第50页第50页磁性纳米粒子表面SiO2修饰气溶胶高温分解法制备中空和实心磁性SiO2微球TEM图及形成机理第51页第51页磁性纳米粒子在临床诊断和治疗中应用体外(in vitro)应用:细胞、蛋白质、DNA、细胞及病毒分离、分析和搜集体内(in vivo)应用:药物磁导向、辅助疾病诊断和治疗第52页第52页磁性纳米粒子在细胞分离中应用磁分离是利用功效化磁性纳米粒子表面配体(或受体)与受体(或配体)之间特异互相作用如抗体抗原和亲和素生物素等来实现对靶向生物目
18、的快速分离。第53页第53页细胞分离磁分离过程示意图第54页第54页细胞分离磁分离过程示意图.用磁性粒子进行标识材料;未标识材料;第55页第55页细胞磁分离技术长处磁性载体与细胞辨认过程基本上能够确保不破坏细胞形态,同时也不影响非辨认细胞分离纯度能够高达95-99.9%不影响细胞功效和活性,经磁分离细胞存活率能够达到90%以上分离操作以便、快捷第56页第56页细菌和病毒磁分离对于病毒和细菌,常规检测办法检测限通常只能过到100cfu/mlXu等最近发展基于磁性纳米粒子检测办法对细菌检测灵敏度能够达到约15cfu/ml第57页第57页细菌和病毒磁分离采用高温分解法制备了油酸油胺稳定FePt纳米粒
19、子,然后通过表面修饰制备了万古霉素(Van)与FePt复合物(FePt-Van)第58页第58页细菌和病毒磁分离利用万古霉素与抗万古霉素肠球菌(VRE)和细菌细胞壁上末端多肽(DAla-D-ALa)之间氢键作用辨认和富集细菌。第59页第59页 利用药物载体磁性特点,在外加磁场作用下,磁性纳米载体将富集在病变部位,进行靶向给药靶向传播第60页第60页磁性纳米粒子应用负载在磁性纳米粒子药物在体内扩散示意图第61页第61页磁性药物长处药物使用量少不必开刀即可将药物投放到患部药物集中,不会对身体其余部分造成副作 用影响结合MRI,可用于新药开发上对于疾病细胞活性、副作用及使用量分析第62页第62页Fe
20、3O4超顺磁性(Superparamagnetic)磁性微粒在有磁场存之下含有强大磁性,但在清除磁场之后,磁性也随之消失。由于这个情形,使Fe3O4磁性纳米微粒可跟踪、可回收也可定量分析,也在生物医学上最早被应用在临床磁共振成像MRI (Magnetic Resonance Imaging)Basic Concept第63页第63页MRI技术能够用来对生物内脏器官和软组织进行无损快速检测,它已经成为诊断软组织病变尤其是检测肿瘤最为有效临床诊断办法之一。超顺磁性纳米粒子在磁共振成像中应用技术关键:增强病变组织与正常组织图像之间对比度以提升病变组织清楚度,需要选择适当造影剂来显示解剖学特性。第64
21、页第64页超顺磁性氧化铁纳米粒子被注入人体后,会出现明显分布特异性。集中分布在网状内皮细胞 丰富组织和器官中,超顺磁性氧化铁颗粒在各组织和器官中分布将有助于提升该部位MRI成像对比度超顺磁性纳米粒子在磁共振成像中应用第65页第65页细胞吞噬磁性粒子过程第66页第66页当前治疗办法: 化学药物疗法:缺乏特异性 放射线疗法: 不宜长时间接受治疗 手术切除:给病人带来生理和心理痛苦 热治疗法:?磁流体致(过)热治疗肿瘤第67页第67页热疗法原理:依据肿瘤细胞和正常细胞对热敏感 性不同,经过加热病灶部位来杀死肿瘤细胞方法。肿瘤细胞在38-40时活性受到克制会趋向凋亡;在40-42时会严重受损,在短时间
22、内死亡;43以上会快速破裂死亡。这就是肿瘤热疗法原理。而热疗不但能杀死肿瘤细胞,还能经过高温阻断肿瘤组织营养,克制肿瘤血管形成和转移倾向。 磁流体致(过)热治疗肿瘤第68页第68页热消融疗法(thermoablation):通常把治疗温度控制在47以上疗法。能使肿瘤组织在高温下急剧坏死,但同时对正常组织也有一定损伤。过热疗法(hyperthermia):把治疗温度控制在42-46之间疗法,重点简介磁流体过热治疗肿瘤(magnetic fluid hyperthermia, MFH)办法。磁流体致(过)热治疗肿瘤技术关键是什么?第69页第69页磁致热早期:将一定尺寸磁性物质(磁针或磁棒)通过手术
23、置于肿瘤部位,然后通过在外加交变磁场作用下发热来达到杀死肿瘤细胞目的。致命缺点:肿瘤内部温度分布不均匀,造成局部温度过高治疗前后都需要手术植入或取出磁体磁流体致(过)热治疗肿瘤第70页第70页磁流体致(过)热治疗肿瘤肿瘤热疗 利用各种物理能量(如微波、射频和超声波等) 所产生热效应,使组织细胞温度升至43以上治疗温度,加速癌细胞死亡疗法。 射频消融超声聚焦全身热疗第71页第71页磁流体致(过)热治疗肿瘤MFH热疗原理 MFH利用肿瘤细胞和正常细胞对热敏感性不同,经过将磁流体注射到肿瘤组织,然后在外加交变磁场作用下产生能量,再将产生能量释放给肿瘤组织,因为肿瘤中血液供应不如正常组织充分致使肿瘤细
24、胞中热量扩散较慢,结果造成局部温度升高(普通控制在42-46之间),从而达到杀死肿瘤细胞目标。第72页第72页动物试验1979年,Gordon小组初次采用葡聚糖修饰小尺寸(粒径为6nm) Fe3O4磁流体开展了对SD鼠乳腺肿瘤治疗研究。办法:100mg 葡聚糖修饰Fe3O4磁流体通过尾静脉注射方式在10min内注入试验鼠内,代谢48h后,将试验鼠置于强度为38kA/m,频率为450kHZ交变磁场中治疗12min结果:体外结果表明12min后,肿瘤组织温度增长了8。通过一星期治疗后,12只试验鼠中有11只肿瘤已经退化。电镜观测发觉Fe3O4粒子除了集中分布在试验鼠肝、脾、肾器官以外,还分布在肿瘤
25、细胞内部。第73页第73页磁热疗将磁性粒子输送至治疗区域,在外加交变磁场作用下,磁性微粒因磁损耗而发热产生热疗作用疗法。第74页第74页细胞内热疗Jordan等发觉癌细胞吸取磁性粒子量是正常细胞8400倍;含纳米铁磁微粒肿瘤细胞极易受到磁热疗杀伤 细胞内热疗含有极佳靶向性第75页第75页与早期相比长处:用于MFH治疗磁流体能够通过注射方式被注入到病患部位,从而能够避免手术给患者带来痛苦含有超顺磁性磁流体较大尺寸磁棒有更高磁致热效率纳米尺寸超顺磁性纳米颗粒能够很容易地进入细胞或组织内部,更均匀进分布在病患部位,有助于克服磁针或磁棒所面临涡流效应,造成受热部位温度不均匀第76页第76页存在问题尺寸
26、控制问题在水溶液中分散性生物相容性安全问题第77页第77页总 结纳米磁性生物技术在医学临床上应用将会飞速发展 肿瘤靶向性治疗纳米技术,可望在内征服一部分恶性肿瘤 纳米磁性生物材料作为人体内植入物还存在一些弊端第78页第78页 生物体系纳米结构矿化第79页第79页 自然界中充斥了各具特性生物矿化材料。贝壳、珊瑚、鱼骨、牙齿、细菌中磁性晶体等仅仅是生物所设计众多生物矿物种类一小部分。无机矿物与有机高分子共同构成许多复杂生物材料,这些材料含有各种各样形状,同时也含有各种功效,其结构这精细,功效之优秀令人叹服 。生物矿化魅力?第80页第80页第81页第81页第82页第82页生物矿化材料主要无机成份,即
27、碳酸钙、磷酸钙、氧化硅,、和铁氧化合物,均广泛存在于自然界中,甚至有矿物(方解石、羟基磷灰石)从构成和结构方式来看与岩石圈中相应矿物都是相同,但一旦受控于这种特殊生命过程,便含有常规陶瓷不可比拟长处。极高强度比较好断裂韧性减震性能表面光洁度生物矿化魅力第83页第83页生物矿化:以生物材料为模板无机结构材料生成生物矿化常见元素: 氢、碳、氧、镁、硅、磷、钙、锰及铁生物体内其它基本元素 氮、氟、钠、钾、铜、锌等则很少矿化非生物所需元素银、金、铅、铀等出现在外细胞壁中,而细胞内部则有锶、钡等元素沉积生物矿化第84页第84页生物矿物种类和功效化学式俗名实例密度硬度(莫氏)CaCO3方解石乌龟壳、珊瑚2
28、.713CaCO3文石海洋动物、软体动物外壳2.933.5-4CaMg(CO3)2白云石棘皮动物牙2.853.5-4MgCO3菱美石海绵刺3.014Ca5(PO4)3(OH)羟基磷灰石骨、牙,幼年软体动物骨3.1-3.25SiO2(H2O)无定形水合硅海绵刺20-225.5-6.5CaF2萤石-3.184CaSiO3硅灰石-2.95生物器官中存在主要无机物第85页第85页20世纪 2030年代,德国、丹麦、瑞典学者有偏光显微镜对生物矿物进行系统观测5060年代,西北欧及美国学者借助TEM和SEM对生物矿物做了进一步研究并建立了有机基质概念70年代以来,伴随各种微观分析技术发展,人们探明了绝大部
29、分主要矿物体系结构和成份,并将生物矿物研究提升到无机化学、细胞生物学、分子生物学乃至基因水平1988年,我国化学家王夔将生物矿物概念简介到国内,国内研分才开始形成规模进展概况第86页第86页英国Mann小组把生物矿化过程分成了四个阶段: 超分子预组织 界面分子辨认 矢量规划(化学处理) 细胞加工过程生物矿化过程第87页第87页生物矿化四个阶段及其功效示意图第88页第88页Schematic diagram of nacreous(珍珠质) structure. The organic thin film indicated between the layers also covers all
30、other surfaces of each structural unit.生物矿物第89页第89页生物矿化一个典型例子鲍鱼壳鲍鱼壳珍珠层薄板状文石珍珠层含有特异断裂性能,高于普通文石2-3个数量级!第90页第90页生物矿化一个典型例子鲍鱼壳 美国加州大学Belcher研究了从红鲍鱼壳中提取三个蛋白质家族对鲍鱼壳矿物晶体控制作用: 1. 方解石形核蛋白 2. 控制方解石、文石相、位向、形貌多个聚阴离子蛋白 3. 决定珍珠层文石板层尺寸和晶体大小基质蛋白第91页第91页生物矿化一个典型例子鲍鱼壳 鲍鱼在结构鲍鱼珍珠层时使用两种不同结构形成机制: 1. 原子和纳米水平上控制矿物结构和位向 2.
31、控制微米尺度上结构有序性 第92页第92页聚合物控制矿化含有多层结构方解石晶体方解石晶体仿生矿化第93页第93页胶原蛋白调制碳酸钙晶体形貌(a)不存在蛋白质时形成方解石晶体形貌;(b)胶原蛋白浓度10g/L时形成方解石晶体形貌第94页第94页胶原蛋白调制所得碳酸钙晶体XRD图谱晶体模型K曲面F平面S阶梯面第95页第95页生物矿化一个典型例子骨层状骨结构图 人工骨结构图 第96页第96页骨非细胞结构包括三个主要部分:胶原 (质量百分数为20%)、羟基磷灰石 (HAp,质量百分数为69%) 和水 (质量百分数为9%)。另外尚有少许有机物质,如蛋白质、聚糖、脂类等。其中胶原以微纤维形式存在,这也是骨含有良好韧性主要原因。胶原纤维尺寸约为100- nm。HAp (通常是含碳磷灰石) 晶体紧密而规律排列在胶原基体中,使骨含有一定硬度。HAp呈厚板状或细长杆状结晶,长度约为40-60 nm,宽度约为20 nm,厚度仅为1.5-5 nm。HAp晶体沿胶原纤维呈平行排列,方向与纤维长轴一致。胶原纤维在骨板中沿哈佛氏管呈螺旋状排列。即使骨构成是常见胶原纤维和HAp,但是由于这两种物质形成了复杂而规律三
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