免疫组化方法研究女性胎儿尿道括约肌的神经支配

1、免疫组化方法研究女性胎儿尿道括约肌的神经支配【摘要】目的讨论支配女性尿道括约肌神经纤维的定位、定量及定性。方法12例21周至40周的女性胎儿尿道，分别进展石蜡包埋、胆碱乙酰基转移酶(hlineaetylatransferase,HAT)及神经肽Y(neurpeptideY,NPY)免疫组化染色，并对其结果进展半定量和定量分析。结果从尿道内口至外口，神经肽Y阳性区域显色范围逐渐变孝强度减弱，胆碱乙酰基转移酶阳性区域主要位于尿道中三分之一，统计学上具有显著性差异。结论尿道括约肌的胆碱乙酰基转移酶及神经肽Y免疫组化染色对理解参与控尿的尿道括约肌神经支配提供了很有价值的帮助。【关键词】控尿神经支配尿道

2、括约肌免疫组织化学InnervatinfthefealehuanfetusurethralsphinterbyiunhistheialstudiesABSTRAT:bjetiveTexplrethelatin,quantityandnaturefnervefibersinnervatingtheurethralsphinter.ethdsUrethraf12fealehuanfetusesbeteen21and40eeksfgestatineretreatedbyparaffinebeddedithhlineaetylatransferase(HAT)andneurpeptideY(NPY)i

3、unhistheialstaining.Thestainingresultsereanalyzedquantitativelyandseiquantitatively.ResultsFrtheurethrainternalrifietexternalrifie,thepsitivereginfNPYbeaesallerandthedensitythinner;thepsitivereginfHATasainlylatedintheiddlepartfarethra,andthereasstatistiallysignifiantdifferenebeteenthe.nlusinTheiunhi

4、stheialstainingfhlineaetylatransferaseandneurpeptideYintheanatialstruturesftheurethralsphinterprvidesabetterunderstandingftheriginandnatureftheinnervatinpartiipatinginurinaryntinene.KEYRDS:urinaryntinene;innervatin;urethralsphinter;iunhistheitry女性尿道括约肌的内在机制是由平滑肌和横纹肌成分组成，它们各自承受互相独立的神经支配，这些机制目前尚不非常清楚1

5、。大多数学者认为女性尿道括约肌是由来自阴部神经(躯体神经)和盆丛(自主神经)的神经纤维共同支配2，但有关女性尿道括约肌及其支配神经准确的定位、定量及定性方面的研究在国内外报道较少。本实验采用免疫组织化学染色及显微图像分析技术，对国人正常女性胎儿尿道的胆碱能及肾上腺素能神经进展定位、定量研究，从而讨论它们在控尿方面的作用。1资料与方法1.1资料选取12个正常女性胎儿，21-40周胎龄。测其冠臀长度为165-340，胎儿死亡1h内完好取下尿道，尿道长度为9-15，另取成人新颖大脑皮质及肾上腺髓质标本做阳性对照，以上标本均经40g/L多聚甲醛固定后石蜡包埋。我们应用12个21-40周胎龄的女性胎儿尿

6、道，是因为胎儿在妊娠15周时横纹肌和平滑肌之间已显示出明显的区别3，这个阶段的胎儿可以在肉眼下解剖，括约肌的根本类型已经建立4。1.2试剂和仪器NPY多克隆抗体购自武汉博士德生物制药，HAT多克隆抗体及AB检测试剂盒购于北京中杉金桥生物技术，Bigenexi6000全自动免疫组化染色系统由广州新捷仪器消费，Quantiet970型显微图像分析仪产自英国剑桥仪器公司。1.3方法1.3.1制作切片将石蜡包埋的女性尿道标本从内口至外口做连续切片，片厚4，根据尿道长度平均分成8个截面，加之内、外口，每个截面各取2张切片，分别做HAT和NPY染色。1.5统计学分析实验数据用s表示，统计分析采用SPSS1

7、1.5软件包，两样本均数差异应用t检验，P0.05为差异有显著性。转贴于论文联盟.ll.2结果观察21-40周女性胎儿尿道的组成，可见胎儿尿道已具有三层根本构造，发育良好：内层为充满皱折的黏膜，中间为黏膜下血管组织，外层为纤维肌肉鞘，由平滑肌和横纹肌弹性组织组成。2.1肾上腺素能神经的分布NPY免疫组化染色分析提示，交感神经介质NPY免疫组化阳性纤维呈棕黄色，多位于血管壁中层平滑肌细胞间和神经束中，在局部细小动脉壁可观察到较粗大的阳性纤维。从尿道内口至外口，NPY染色阳性区域(尿道平滑肌)逐渐变小，颜色变浅，至外口处几乎完全消失(图1)。将NPY免疫组化反响强度“0-3数字化后结果可见：近1/

8、3与远1/3，中1/3与远1/3之间差异均有显著性(P0.01)，但近1/3与中1/3之间差异无显著性(P0.05，表1)。图112例女性胎儿尿道免疫组化染色分析(半定量)略2.2胆碱能神经的分布从HAT免疫组化反响染色分析可见女性胎儿尿道的中间1/3染色最强，近端1/3次之，远端1/3最弱。将HAT免疫组化反响强度“0-3数字化后结果可见：远、中、近端三者差异均具有显著性(P0.01，表1)，在膀胱颈部和尿道近1/3横纹肌纤维很少。表1女性尿道NPY与HAT免疫组化分析结果略注：近1/3是指图1中从内口至2；中1/3是图1中从3至5；远1/3是图1中从6至8.与远1/3比拟*P0.01；与中

9、1/3比拟P0.013讨论关于此项研究内容，国外的研究结果并不完全相符，甚至结论互相矛盾。女性尿道的复杂构造组成了混合的神经支配：自主神经支配平滑肌，躯体神经支配横纹肌，自主神经和感觉神经支配黏膜和黏膜下组织。平滑肌和横纹肌的连接也非常严密，使得识别支配每种肌肉构造的神经纤维变得非常困难5。女性尿道的尿道内括约肌主要由交感、副交感神经支配，尿道外括约肌主要由躯体神经支配，其中交感神经和副交感神经节前纤维为肾上腺素能神经，副交感神经节后纤维和躯体神经为胆碱能神经，其神经纤维末稍释放乙酰胆碱，作用于尿道外括约肌的N型胆碱能受体，引起该肌收缩，阻止尿液排出。乙酰胆碱作为神经递质，作用于靶受体发挥作用

10、。胆碱乙酰基转移酶是胆碱能神经元的标志酶，是乙酰胆碱的合成酶，分布在胆碱能神经元和纤维内；肾上腺素能神经释放单胺类递质，故可以用显示单胺类递质的方法来研究肾上腺素能神经纤维的分布，神经肽Y(NPY)是肾上腺素能神经的标志性神经肽。应用免疫组化染色来研究两种神经递质含量的多少，可说明神经的兴奋性上下，能充分反映神经的功能,是理解胆碱能、肾上腺素能神经及其所支配器官的重要方法。本实验研究对尿道肌肉组织进展组织学和免疫组织化学分析显示，在女性胎儿尿道的膀胱颈及近端三分之一，横纹肌纤维相对较少，这与Brirakhanyavat等6的观点相矛盾，他们发现胎儿的横纹肌纤维出如今尿道的近端及中间三分之一处，

11、认为胎儿尿道的横纹括约肌向近端延伸，这些纤维在后侧外表是不完好的。Stlzenburg等7认为女性膀胱逼尿肌止于尿道内口，与尿道无任何延续，尿道平滑肌的内纵肌在近端三分之一开场变薄，远端三分之二逐渐消失，外纵肌多数在尿道内口处消失，中间环形肌那么在近端三分之一形成强大的环形平滑肌括约迹本实验经过平滑肌标志性抗体(NPY)免疫组织化学染色证实，该括约肌向远端尿道逐渐减少，开场减少处恰好为横纹括约肌可检测的部位。在中间三分之一尿道平滑肌和横纹括约肌环绕整个尿道，平滑肌在尿道远端三分之一处消失。横纹括约肌开场于尿道近端三分之一的远端，位于平滑肌的外侧，向远端逐渐增厚。本实验研究还从HAT及NPY免疫组化染色分析中发现女性胎儿尿道的中间1/3染色最强，在女性胎儿尿道的平滑肌与横纹括约肌之间并没有明显的界限，在尿道中三分之一处可清楚地看到平滑肌和横纹肌纤维互相交织分布，逐渐过渡，形成所谓的尿道括约肌复合体，是女性重要的控尿机制。StEin等8通过尿动力学检查发现，女性患者全膀胱切除术后施行原位尿流改道，其控尿功能完全依靠横纹括约肌，虽然尿道长度缩短了1.3，最大尿道压下降12H2，却仍能有效地控制排尿。Rther等9认为女性尿道的平滑肌具有括约肌作用，主要在持续控尿过程中发挥作用，可以控制尿道的关闭。横纹括约肌可以随意中断排尿、对抗压力性尿失禁，横纹括约肌在中间三分之一处最厚并且