川大学-生物技术-综合实验报告-学生版

1、生物技术综合实验甘薯 -谷氨酰半胱氨酸合成酶 ( -GCS)基因的克隆和原核表达学生 ：学号：同实验者 ：研究背景谷胱甘肽 (glutathione, GSH) GSH 具有多种重要生理功能 , 抗自由基和抗 氧化应激作用 , 保护细胞膜的完整性等。 -GCS是植物细胞中 GSH生物合成的 限速酶 , 可以调控 GSH的生物合成量。 GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、 真菌等胁迫过程中起着重要作用 , 说明 -GCS也与植物抗逆过程密切相关。实验一 甘薯叶片 RNA提取一、实验目的了解真核生物 RNA提取的原理；掌握 Trizol 提取的方法和步骤。二、实验原理Trizol? 试剂是由苯酚

2、和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总 RNA的试 剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持 RNA 的完整性。 TRIzol 的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中 的蛋白，核酸物质解聚得到释放。 苯酚虽可有效地变性蛋白质， 但不能完全抑制 RNA酶活性，因此 TRIzol 中还加入了 8羟基喹啉、异硫氰酸胍、 - 巯基乙醇 等来抑制内源和外源 RNase(RNA酶)。%的 8羟基喹啉可以抑制 RNase，与氯仿 联合使用可增强抑制作用。 异硫氰酸胍属于解偶剂， 是一类强力的蛋白质变性剂， 可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失， 导致细胞结构降解， 核蛋白迅

3、速与核酸 分离。 - 巯基乙醇的主要作用是破坏 RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、 离心分离后， RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀 RNA。用这种方法得 到的总 RNA中蛋白质和 DNA污染很少。三、实验材料材料甘薯（ Ipomoea batatas Lam ）叶片，品种为徐薯 18试剂无 RNA酶灭菌水：加入 %的 DEPC，处理过夜后高压灭菌；Trizol 试剂；氯仿；异丙醇、 75乙醇；TBE 缓冲液；上样缓冲液（ 6）仪器 高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成 像系统、塑料离心管、枪头和 EP管架四、实验方法将叶片取出放入研钵中，加入适

4、量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg 植物叶片加入 1 mL Trizol 试剂，室温放置 5 min ，使样品充分裂解；每 1 mLT rizol 试剂加入 200 L氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置 3-5 min 使其自然分相；4 12,000 rpm 离心 15 min ，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入 等体积冰冷的异丙醇，室温放置 15 min ；4 12,000 rpm 离心 10 min ，弃上清， RNA沉淀于管底；RNA 沉淀中加入 1 mL 75%的乙醇（用 RNase-free 水配制），温和震荡离心管， 悬浮沉淀； 4 8,000 rpm 离心 2 mi

5、n ，弃上清；室温放置 10 min 晾干沉淀；沉淀中加入 20L RNase-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解 RNA，- 70保 存；用 1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用 EB染色并照相五、实验结果1. RNA提取结果依照 Trizol? 试剂盒方法，提出的 RNA较少，此部分未以图或数据显示。2. RNA 后电泳结果如图 1. 其中 9a 为本组实验结果。由图可知 RNA条带非常模糊，拖尾现象 严重，几乎无法分清具体条带，亮度较大。点样孔附近的红色部分为杂质，在提 取过程中并未很好除去。图 1. RNA提取跑胶结果。其中 1 泳道为样品 Marker ， 9a 泳道为本小组 R

6、NA样品。与标 准对照可见条带模糊，拖尾现象严重。六、分析与讨论1. RNA 的提取产量并不多， 可能是因裂解样品不充分或 RNA沉淀未完全溶解所致。 在实验 过程中， 由于对操作时间的掌握不熟练、 操作技巧不完善， 留上清与弃上清时令 RNA损失了部分，使最终 RNA产量不理想。2. RNA 电泳结果有 EB存在时，电泳后 28S rRNA和 18S rRNA 在紫外灯下应看得很清楚，另出现条由 tRNA， rRNA和 5S rRNA组成的较模糊、迁移较快的带。如果 RNA没有 降解，则 28S rRNA的亮度应为 18S rRNA的 2 倍，且这两条带都无弥散现象发生。 由图 1. 9a

7、可知， RNA拖尾现象严重，说明 RNA已大部分被降解；此外点样孔附 近出现红色部分杂质，分析可能有并未除尽的蛋白质，同样影响RNA电泳结果。在进行实验时，本小组成员未严格戴上口罩并勤换手套，这可能使外源 RNAase进入样品，导致其降解严重。另外，提取出 RNA后本小组未立即将样品 放入- 70保存，也为导致结果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分层 的过程中，由于水相吸取过多，掺杂入部分蛋白质杂质而未于后续纯化步骤除尽， RNA条带拖尾严重可能还受该蛋白质影响。七、总结：本次试验 RNA提取非常失败， 从跑胶结果可见其降解严重。 虽然大实验无法 避免试剂交叉污染的可能性，且电泳用胶的质

8、量也会影响实验结果，但从图 1. 2a，3a，2b 等条带较为清晰的小组实验结果可知，琼脂糖凝胶质量以及试剂对 结果干扰不大。 那么本小组成员在提取过程中的操作一定出现了很大失误。 首先 口罩、手套应该严格按规定佩戴， 提取过程对移液枪等仪器使用需谨慎仔细， 尽 量避免混入杂质。 其次为排除部分杂质影响可对 RNA样品用紫外线分光光度计测 定吸光值检验，将有助于结果分析。最后，细节决定成败，我们应汲取教训避免 接下来的实验出现类似问题。实验二 第 1 链 cDNA的合成和模板的验证一、实验目的掌握第 1 链 cDNA的合成方法和步骤二、实验原理真核生物基因多为断裂基因， 编码区不连续， 需经转

9、录后加工才能成为成熟 mRN。A 以真核成熟 mRNA为模板合成 cDNA，进而获得有连续氨基酸编码的 DNA序 列，无需转录后加工，即可在原核细胞中表达。真核生物的 mRNA都有 PolyA 尾巴。引物： Oligo dT （ 12-18 个 T）。莫洛尼Total RNA2 L氏鼠白血病毒逆转录酶 （M-MLV） 以单链 RNA为模板， 在引物的引发下合成与模 板互补的 DNA链（ cDNA）。mRNA 反转录生成的 cDNA可作为 PCR的模板进行扩增称为 RT-PCR， RT-PCR 比 Northern 杂交更灵敏，对 RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平 上检测基因时空表

10、达的常用方法。三、实验材料材料徐薯 18 叶片 RNA样品试剂dNTP mixture ( 10 mM each)； TOC o 1-5 h z Oligo (dT) Primer (10 M)；Total RNA ；RNase free ddH2O ；M-MLV 反转录酶；5 First-strand Buffer；M DTT ；Ribonuclease Inhibitor (40 U/ L)仪器10L 和 100L 的移液枪、的 EP管、 PCR仪等四、实验方法1. 在 RNase free Microtube 管中配制下列混合液：1 L4 LdNTP mixture (10 mM eac

11、h) *Oligo (dT) Primer (10 M)RNase free ddH 2Oup to 12L2. 将混合物 65 C加热 5 min ，迅速在冰上冷却 2 min ，快速离心，然后加入下列成分：5First - strand Buffer4LM DTT 2LRibonuclease Inhibitor (40 U/L)1 L3. 将混合物轻轻混匀， 37温浴2 min ；加入 M-MLV反转录酶（ 200U/L）1 L，用枪头轻轻吹打混匀；37 温浴 50 min ；70 加热 15 min ，使反转录酶失活，所得反转录产物可直接用于 PCR反应附 反转录模板的看家基因的验证（

12、 -actin ） 引物primerssequencessizeIbActinF5-TTCCCCGGTATTGCGGATAGAATG-3198bpIbActinR5-CGGACCGGACT CATCATACTCTG -3以第一链 cDNA为模板，-actin-F 和 -actin-R 为引物，使用 Taq 酶进行 PCR。表 1 -actin PCR 反应体系（ 25L体系）DNA模板1L(约 50 ng)10PCR缓冲液(Mg2+ plus)LMg2+L10 mol/L TPS -F1 L10 mol/L TPS -R1Lmmol/L dNTPLTaq 酶L灭菌去离子水L合计25 L* PC

13、R反应条件94 2min95 30sec30个循环62 30sec6830sec最后， 1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物。五、实验结果-actin 验证如图 1. 其中编号 1为 Marker，3为本小组 RNA样品-actin 验证结果。 由图可知，使用 RNA模板通过 RT-PCR得到了长度为 198bp类似条带，但因产物 浓度较低，该条带不甚清晰，并有部分弥散现象发生。图 1. -actin 验证电泳结果。其中编号 1为 Marker ，编号 3为本小组 RNA样品经 RT-PCR 在加入引物 IbActinF 、 IbActinR 后扩增出的-actin 产物。六、分析与讨论1. RN

14、A 提取因实验一本小组 RNA提取失败，故此实验采用老师准备的 RNA进行验证。-actin 验证结果如图 1. 第 3组为本小组验证结果。其中 -actin 能被 cDNA模板扩增出， 但条带模糊并有拖尾现象出现。首先，因所得产物量较少，故电泳条带模糊，推 测可能是在进行 RT-PCR前， RNA有部分降解或于操作过程中损失部分所致。其 次，本实验在对-actin 产物进行电泳后结果出现拖带，可能原因主要有： 1) cDNA第一链产物的含量过高； 2) DNase降解 DNA产生的寡核苷酸有非特异性扩 增； 3)PCR反应中引物过多； 4)循环次数过多； 5)退火温度过低； 6)Taq 酶

15、过多； 7)Mg2+浓度不合适。综合本次试验分析，因实验条件已预先经过尝试， 故导致拖带的最可能因素应为 cDNA降解产生了寡核苷酸非特异性扩增片段。由 于照片清晰度欠佳，非特异性扩增片段无法清晰显示，但若与图 2. 进行对比则 可发现第 2 组 -actin 验证图出现了非特异性扩增片段。图 2. 第 2 组 -actin 验证图。其中 1为 Marker ，编号 2、6 可见清晰的两条带。 若要进行改进，则需尽量提取高质量 RNA，防止其被 DNA污染。另外进一步 优化 PCR反应条件也是必不可少的环节， 提高退火温度可防止非特异性起始与延 伸。七、总结本次实验虽只进行了模板验证，但让我们

16、理解了 RT-PCR的原理与其在真核 生物基因克隆方面的运用。整个过程中本小组成员较严格按照操作规范进行，所得-actin 产物验证也较成功。今后实验需更加注意细节，不断完善自己的操作技巧，积累经验。实验三 甘薯 -谷氨酰半胱氨酸合成酶 ( -GCS)基因克隆一、实验目的1. 掌握 PCR的方法和步骤。二、实验原理聚合酶链反应 (PCR)是 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特 异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；目的基因或 某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。 其特异性依赖于与靶序列两端 互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性- 退火- 延伸三

17、个基本反应步骤构成：模板 DNA的变性：模板 DNA经加热至一定温度后， 使模板 DNA双链解离， 成为 单链，与引物结合，为以下的反应作准备；模板 DNA与引物的退火 (复性)：模板 DNA经加热变性成单链后， 温度降至 55 左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合。引物的延伸： DNA模板 - 引物结合 物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP为 反应原料，靶序列为模板， 按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性 - 退火- 延伸三过程， 就可获得更多的“半保留复制链”， 而且这 种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循

18、环需 2-4 分钟，2-3 小时就能将 待扩目的基因扩增放大几百万倍。三、实验材料材料反转录产物 DNA样品2. 试剂dNTP mixture ( 10 mM each)；第一 cDNA ； -actin 的引物 ( IbActinF 和 IbActinR )； -GCS的引物 ( -GCS-F 和 -GCS-R )；10 PCR缓冲液 (Mg2+ plus) ；Taq 酶；仪器PCR 仪、 L、10L 和 100L 的移液枪、的 EP管、电泳仪。四、实验方法1. 扩增甘薯 -GCS基因的引物primerssequencesSize-GCS -F-GCS -R:5- CGGGATACTCGGC

19、GTTGATGTCCCAATCTG-3 斜体： BamHI 酶切位点1575bp:5- CCGCTCGTACGAATAGAGCAGCTCCTCAAATAC-3 斜体： XHOI 酶切位点甘薯 -GCS基因的 PCR扩增 甘薯 -GCS基因的 PCR扩增体系（表 2）（25L体系）以第一链 cDNA为模板， F 和 R为引物，使用 Taq 酶高保真酶进行 PCR；表 2 -GCS PCR 反应体系DNA模板1L(约 50 ng)10PCR缓冲液 (Mg2+ plus)LMg2+L10 mol/L -GCS -F1 L10 mol/L -GCS -R1Lmmol/L dNTPLTaq酶L灭菌去离子

20、水14 L合计25 L. PCR 反应条件944min94 40sec65 30sec35 个循环72 2min1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物，并进行胶回收纯化；甘薯 -GCS基因 PCR产物胶回收按照胶回收试剂盒的说明书进行：1）将 PCR产物在 1%琼脂糖凝胶中电泳，5V/cm电泳 1 h 后，溴乙锭（或者 Goldview ） 染色，在紫外灯下切下 2500 bp 左右大小片段的凝胶；2）称凝胶重量，按 1 g/mL 体系加 Binding buffer ，在 55C水浴中孵 5 min ， 直到凝胶完全溶解；3）将凝胶溶液到 DNAs pin-column 中，室温放置 2min ，

21、1,2000 rpm离心 1 min， 弃废液；4）用 700 L washing buffer 洗涤柱子， 1,2000 rpm 离心 1 min ；5）弃废液后再 1,2000 rpm 离心 2min，以除去残存的 washing buffer ；6）把 column 放到另一干净的 mL 离心管，加 50L elution buffer ，室温放置2 min 后， 1,2000 rpm 离心 1 min 以洗脱 DNA；pET-32a 质粒的 BamHI 和 XHOI 双酶切 酶切体系（ 10L体系）： buffer ( BamHI) 1 LBamHI LXhoIL质粒L酶切反应： 37

22、水浴中孵化 1h；甘薯-GCS合成酶基因胶回收产物的 BamHI和 XHOI 双酶切酶切体系（ 10L体系）：buffer ( BamHI) 1LBamHILXhoILPCR胶回收产物L酶切反应： 37水浴中孵化1h 。五、实验结果1. 甘薯 -GCS基因 PCR电泳图如图 1. 其中 1 为 Marker（最大片段 2kb），4a 为本小组甘薯 -GCS基因 PCR扩增产物。由图可知该组各条带均较明亮清晰，模板经引物 R、F 扩增后得 大小在 1575bp 左右的目标产物，即约，跟 Marker 对比并进行了标注（图 1. 红 色框）。另图中除标注部分以外还出现多余条带，但因后续实验采取割胶

23、回收方式获得 -GCS基因片段，故其余片段不会对实验结果造成影响 -GCS基因左右右图1. 甘薯 -GCS基因 PCR电泳图。其中编号 1为 Marker ，4a 为本小组 -GCS基因 电泳结果。红框已圈出 -GCS所在条带位置，大小在左右。六、分析与讨论1. 甘薯 -GCS基因 PCR电泳结果由图 1. 4a 可知，本次甘薯 -GCS基因 PCR较为成功。该产物条带比较明亮，边缘整齐，但除目的条带外仍扩增出了不少多余条带， 说明 DNA模板存在小 部分降解。实验过程中应尽量避免 DNAase污染以及机械剪切力损伤样品，而操 作时更应注意加样时间， 经分析电泳结果出现非目的基因小片段可能是加

24、样时间 过长引起的。，以使另外，本实验在电泳时还可设计阴性对照（灭菌去离子水、缓冲液） 结果更加完善胶回收与双酶切由于严格按照实验步骤进行，胶回收与双酶切均完成较好。此处未以数据、 图片表示。七、总结本次实验包括 PCR -GCS基因片段（目的基因）并作电泳检测、胶回收纯 化目的基因以及 BamHI、XhoI 双酶切质粒与目的基因三个步骤。 由实验结果可知 目的基因扩增较为成功，虽有多余杂质出现但条带仍然清晰、整齐。胶回收时， 溶液放置 2min 是为使 buffer 与产物溶液混合均匀并稳定以减少杂质影响， 最后 双酶切的孵化时间与温度是关键， 故于操作过程中我们应注重细节， 多体会才能 理

25、解、掌握成功要领。实验四 原核表达质粒构建一、实验目的掌握连接和转化步骤。二、实验原理DNA 体外连接即在一定条件下， 由 DNA连接酶催化两个双链 DNA片段相邻 5 端磷酸、 3端羟基间形成磷酸二酯键的过程， DNA分子的连接是在酶切反应获 得同种酶互补序列基础上进行的。 连接反应成功与否， 最后的检测要转化宿主菌、 阳性克隆的筛选来确定。 质粒转化不同细菌有不同的转化效率， 转化效率的高低 与实验的成败直接相关，通常转化效率可达 105-107转化子/ g DNA，获得高转 化效率的关键是感受态细菌的制备。体外通过基因工程手段所构建含目的基因的重组质粒，通过转化和筛选技 术，可获得含重组

26、子的阳性克隆。在此阳性克隆中， DNA可在生物体系内大量扩 增、繁殖、保存及表达目的基因产物，这是 PCR体外扩增 DNA所不能替代的。配 合 DNA重组技术所获得的阳性菌株已广泛应用于科研， 医药生产和生物发酵等领 域。三、实验材料材料甘薯 -GCS基因酶切片段、载体片段2. 试剂10 T4 DNA ligase buffer ；T4 DNA ligase ；ddH2O ；SOC 培养液；buffer BamHI ；DMSO；TFB 溶液（100 mmol/L KCl, 45 mmol/L MnCl 2，10 mmol/L CaCl 2,10 mmol/L K-MES ；- 巯基乙醇；仪器：

27、10L 和 200L 移液枪、的 EP管、离心机、培养皿、电泳仪、 37 培养 箱、 4 冷藏室四、实验方法1. 甘薯 -GCS基因酶切产物与 pET-32a 酶切产物的连接连接体系（ 10L体系）：10T4 DNA ligase buffer1载体片段4LPCR酶切片段3LT4 DNA ligaseLddH2OL连接条件： 16连接过夜；2. 大肠杆菌感受态细胞的制备1）接种 JM109于 2 mL SOB培 养基 中， 37振荡培养过夜；2）取 mL菌液转种于 50 mL SOB培养基中， 37振荡培养 h （OD 550值约为后， 冰浴 10 min ，4, 000 r/min 离心 5

28、 min ，弃上清液；3）加入 17mL预冷的 TFB溶液（100 mmol/L KCl, 45 mmol/L MnCl 2，10 mmol/L CaCl2,10 mmol/L K-MES 洗涤菌体 1 次，离心收集菌体；4）加入 4 mL TFB制成悬液，冰浴 10 min ，加入 140L二甲基亚砜 （DMSO，） 冰浴上轻轻转动 10 min，加入 140 L -巯基乙醇，于冰浴上轻轻转动 10 min， 再加入 140 L DMSO，轻轻混匀后在冰浴上静置 5 min ，即得感受态细胞；连接产物的转化1）在预冷的 EP管中加入 1-10 L质粒 DNA，加入 200 L上述感受态细胞，

29、 混匀后在冰浴上静置 30 min ；2）42水浴热冲击 30 s，冰浴上放置 10 min，加入 mL SOC培养液。置于 37 振荡培养 1 h ；3）取 mL 涂布于加有抗生素的 LB培养基平板上， 37 培养过夜。若转化子很 少，特别是连接 DNA的转化，可将转化细胞离心 3 min （4,000 r/min） ，弃上清 液，把所有的菌体涂布在含相应抗生素的平板上；4）正放于 37培养箱内约 1h 使接种物完全被吸收，然后将平板倒置于 37培 养箱中培养， 1216h 后，将平板移入 4 （ 冰箱冷藏室 ） 放置数小时；质粒的小量提取：采用试剂盒（ Plasmid Mini Kit I

30、 ）方法进行提取 实验前准备：1）使用前，将 RNase A全部加入 Solution I 中并于 4度保存；2）按下表用无水乙醇稀释 DNA Wash Buffer ，并于室温保存；D6942-00, 3 ：加入 ml 无水乙醇D6942-01,D6943-01 ：加入 80ml 无水乙醇D6842-02,D6943-02 ：每瓶中加入 80ml 无水乙醇离心操作方案：1）将带有质粒的 接种于5ml LB/ 抗生素培养液中， 37C摇床培养 1216 h；2）取的菌液，室温下 10,000 xg 离心1min收集细菌；3）倒弃培养基。加入 250ul Solution I/RNaseA混和液

31、，漩涡振荡使细胞完全悬 浮；4）往重悬混和液中加入 250ul Solution II ，轻轻颠倒混匀 4-6 次。此操作避免 剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过 5 min ；5）加入350ul Solution III，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀；6）室温下， 10, 000 xg 离心 10min；7）转移上清液至套有 2ml收集管的HiBind DNA结合柱中，室温下 10,000 xg离心1 min，倒去收集管中的滤液；8）把柱子重新装回收集管，加入 500ul HBB uffer ，按上述条件离心，弃去滤液；9）把柱子重新装回收集管，加入 700ul DNAW ash Buffe

32、r ，按上述条件离心，弃 去滤液。注浓缩的 DNA Wash Buffer 在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀 释；10）弃去滤液，重复第 9步骤一次；11）弃去滤液，把柱子重新装回收集管， 10,000 xg 离心空柱 2min以甩干柱子基 质。注不要忽略此步这对去除柱子中残留的乙醇至关重要；12）把柱子装在干净的离心管上，加入 30-50ul Elution Buffer（10mM Tris-HCl, 或无菌水到柱子基质中，静置 1- 2min ，10,000 xg离心1min洗脱出 DNA；重组子的 PCR鉴定。五、实验结果：1. 重组质粒粗提检测如图 1. 粗提后均出现了大小不同的

33、质粒， 较小者应为 pET-32a 质粒载体以 及原有质粒，较大者为重组质粒，而重组阳性质粒则需后续实验鉴定。其中 4a 为本小组提取结果， 由于拍照条件不佳， 最大条带较模糊 （图中红色方框圈出） ， 但仍能辨别出 3 条带。原有质粒与 pET-32a 质粒空载体条带最亮， 而成功转化的 重组质粒条带相对暗淡，很难分辨清楚。图 1. 重组质粒粗提电泳检测图。 其中 4a 为本小组样品条带， 红框圈出部分为重组质粒， 量较少。重组质粒 PCR检测如图 2. 所示， 2b即本小组实验条带， 9为 Marker 条带（同实验三）。以大 质粒为模板， -GCS- F 、R为引物进行 PCR，得左右条

34、带十分清晰，已由图中标 出。图 2. 重组质粒 PCR电泳检测图。其中 9 为 Marker 条带， 2b 由红箭头所指为本小组重组质粒 PCR条带，大小在左右。六、分析与讨论1. 重组质粒粗提电泳结果如图 1. 可大致观察到重组质粒的形成，但由于产量较少，重组质粒的转化 率不好，分析可能是在进行目的基因与载体连接时成功率较低所致。 另因图中无 Marker 显示，对重组质粒的条带确认增加了难度，单一完整 pET-32a 质粒与 E. Coli 受体菌自身已携带质粒的电泳条带可起辅助分析作用，以使电泳结果更完 整。重组质粒 PCR电泳结果图 2. 2b 条带较为清晰整齐，说明有阳性重组质粒形成

35、，转化成功。但条带 稍有拖尾现象产生， 分析可能是由 PCR过程中升温所导致的质粒不规则变性、 断 裂而引起， 并形成了些大小不一的片段， 电泳时呈弥散状分布于主条带后， 分子 量较大。七、总结本次试验过程中， 因酶切鉴定结果不理想而改用 PCR鉴定。对质粒进行提取 时的机械力损伤、 PCR升温步骤均可导致质粒片段受损，这些失误在操作或实验 设计方面都需尽量避免， 虽然重组质粒量较少但其能成功转化受体菌， 这也为随 后 IPTG 诱导目的基因表达 -GCS产物打下了一定基础。 多做、多思考、多总结， 才能于每个环节中学习到更多知识。实验五 甘薯 -GCS基因的原核表达一、实验目的1. 使用 I

36、PTG 诱导外源基因表达，了解筛选原理；2. 掌握 SDS检测表达蛋白质的原理与方法。、实验原理1. 表达系统是重要的原核表达体系。在重组基因转化入 菌株以后，通过温度的控制， 诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质， 将表达样品进行 SDS以 检测表达蛋白 质。本实验采用异丙基硫代 - -D-半乳糖昔（ IPTG）诱导外源基因表达。lacI 是大肠杆菌中 lac 操纵子（ Operon）的调节基因，它所表达的阻遏蛋 白是 lac 操纵基因（ Operator ）的抑制因子，抑制转录启动。当有乳糖存在时， 这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制，使 lac 操纵子上 的结构基因 lacZ

37、 （-半乳糖苷酶 ） 、 lacY （透性酶 ） 、lacA（ 乙酰基转移酶）得 以正常表达，启动转录。 IPTG（异丙基- -D-1-硫代半乳糖苷 ） 作为乳糖的类似 物与 lacI 阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制， 因此 IPTG 经常作为 lac 操纵子 的诱导剂运用于筛选。2. SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAG）E使用含有十二烷基硫酸钠（ SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸 3-5 分钟），通过加热和 SDS可以使蛋白质 变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。巯基乙醇打开二

38、硫键以使蛋白质分子处于伸展状态。 蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净 电荷以及分子大小和形状等因素。 加入 SDS（十二烷基磺酸钠） 和少量巯基乙醇， 则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量， 而与原来所带电荷、 分子形状无 关。电泳过程中分子迁移的规律为：小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相 当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。四、实验材料1. 材料已得甘薯-GCS基因阳性重组子2. 试剂诱导表达LB 培养基；SOC培养液；50 g/mL Amp；IPTG ；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳30%丙烯酰胺凝胶贮液： 丙烯酰胺 30 g， N, N- 亚甲双丙烯酰胺 g ；4Tris Cl/SDS

39、 pH ： g Tris 碱溶解于 40 mL水中，用 1 mol/L 的盐酸调 pH为后，定容到 100 mL，再加 g SDS；4Tris Cl/SDS pH ： g Tris 碱溶解于 40 mL水中，用 1 mol/L 的盐酸 调 pH为后，定容到 100 mL，再加 g SDS；样品缓冲液： 1 mL 4Tris Cl/SDS(pH ，1 g SDS，2 mL -巯基乙醇， 1 mL %溴酚兰， 5 mL 甘油，加蒸馏水定容到 50 mL；电极缓冲液： g Tris 碱， g 甘氨酸， g SDS；固定液： 50%甲醇， 10%冰醋酸；染色液： %(w/v)考马斯亮蓝 R-250，

40、50%甲醇， 10%冰醋酸；脱色液： 7%冰醋酸， 5%甲醇；SDSLoading Buffer ；3、仪器 电泳仪、染液缸 五、实验方法1. E. coli BL21 (DE3) 感受态的制备；2. 重组子转化 BL21；原核表达挑取上述方法得到的单菌落于 2 mL LB 液体培养基 (氨苄青霉素 50 g/mL) 中。同时， BL21作为对照(不加抗生素) 。于 37培养至 OD600为；2）取 20 L菌液接种 2 mL LB 液体培养基 （ 氨苄青霉素 50 g/mL）, 37 培养 OD600为；3）加入 IPTG 最终浓度梯度 2mM， 18诱导表达 16h；4）诱导结束后，用超声

41、波破碎细胞；5）1mL菌液加入 100L的 SDSLoading Buffer ，100煮沸 5min；6）取 30L上清样品点样，分析 SDS胶，观察表达结果；按下表配方制备 SDS凝胶，加样。先 10 mA恒流电泳至分离胶，再调为 15 mA恒流到电泳结束；组分12%分离胶 (mL)%浓缩胶 （mL）丙烯酰胺贮液4Tris Cl/SDS, pH-4Tris Cl/SDS, pH-ddH2O10%过硫酸铵TEMED考马斯亮蓝染色（1）将聚丙烯酰胺凝胶用固定液固定 2 h ；（2）倾去固定液，以考马斯亮蓝染色液染色 4 h ；（3）倾去染色液，加入脱色液，缓慢摇动脱色。中间换脱色液，脱色到获得蓝 色条带及干