高二生物16课时学完选修1半年卡人教版讲陆巍巍第14讲pcr二

1、PCR（二）一、PCR条件小结1、PCR基本流程回顾一、PCR条件小结PCR:即多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,二、PCR实验流程PCR), 是一种体外迅速扩增DN段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内出上百万份的DNA拷贝。一、PCR条件小结1、PCR基本流程回顾PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。一、PCR条件小结1、PCR基本流程回顾变性：当温度上升到 90以上时，双链DNA 解聚为单链。复性：温度下降到 50左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合。延伸：温度上升到 72左右，溶液中的四种脱氧

2、核苷酸在一个循环TaqDNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则链。新的DNA1一、PCR条件小结1、PCR基本流程回顾一、PCR条件小结1、PCR基本流程回顾一、PCR条件小结1、PCR基本流程回顾一、PCR条件小结1、PCR基本流程回顾一个问题：最少需要多少次循环，才能获得DNA目的片段的完整拷贝？从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的 DNA 单链会与引物结合，进行 DNA 的延伸。这样，DNA 聚合酶能特异地处于两个引物之间的DNA 序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。2一、PCR条件小结1、PCR基本流程回顾一、PCR条件小结2、PCR所需条件

3、小结模板DNA：可以是DNA，也可以是RNA，当用RNA作为模板时，需要进行反转录cDNA;DNA模板含量合适，可以减少PCR多次循环带来的碱基错配。一、PCR条件小结2、PCR所需条件小结4种脱氧核苷酸：由四种dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP ）提供，每种的浓度应相等。2、PCR所需条件小结引物：引物的长度过短会影响PCR的特异性，要求有16-30bp。引物过长使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度(72)，亦会影响产物的特异性。四种碱基应随机分布，不要有连续3个以上的相同嘌吟或嘧啶存在。 尤其是引物3端，不应有连续3个G或C，否则会使引物与核酸的G或C富集区错误互补，从

4、而影响PCR的特异性。TaqDNA聚合酶：催化DNA子链，是热稳定性比较好的工具酶，但应注意在-20保存。温度控制：缓冲液、Mg2+：提供PCR反应合适的酸碱度与某些离子， Taq酶的活性需要Mg2+。3【例1】在 PCR 反应中，只有一个 DN【例2】PCR 一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物I 延伸而成的 DNA 单链作模板段作为模板，经过一次循环后，含引物的 DNA 单链占 DNA总链数的（）时将（）A1/2B1/4C1/8D1仍与引物 I 结合进行 DNA 子链的延伸与引物 II 结合进行 DNA 子链的延伸同时与引物 I 和引物 II

5、 结合进行子链延伸D无需与引物结合，在酶的作用下从头子链【例3】利用 PCR 技术扩增目的【例3】利用 PCR 技术扩增目的，其原理与细胞内DNA类似（如延伸的基础，其原理与细胞内DNA类似（如延伸的基础图所示）图中引物为单链 DN图所示）图中引物为单链 DN段，它是子链段，它是子链下列有关 PCR 过程的叙述中，正确的是（下列有关 PCR 过程的叙述中，正确的是（）A PCR 是一项在生物体外技术特定的完整DNA 分子的核酸B C DPCR 过程中只需要两个引物分子Taq 酶的作用是将单个的脱氧核苷酸连接到双链DN段上在第三轮循环产物中开始出现两条核苷酸链等长的DN段4【例4】图表示利用 P

6、CR 技术扩增目的【例4】图表示利用 PCR 技术扩增目的的部分过程，其原理与细胞内的部分过程，其原理与细胞内DNA（类似下列叙述错误的是DNA（类似下列叙述错误的是）从理论上推测，第二轮循环产物中含有引物A 的 DN3/4在第二轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段引物之间或引物自身发生碱基互补配对则不能扩增目的耐热的 DNA 聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到 3端段占【例4】二、PCR实验流程1、实验操作5二、PCR实验流程1、实验操作在 PCR 实验中，需要用到微量离心管，它是一种薄壁二、PCR实验流程1、实验操作管、总体积为 0.5mL。具体操作时，用微量移液管，按照一定

7、的配微量离心管中依次加入各组分。二、PCR实验流程1、实验操作 再参照下表的设置设计 PCR 仪的循环程序即可。二、PCR实验流程2、注意事项为避免外源 DNA 等的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。PCR 所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。使用前5二、PCR实验流程二、PCR实验流程2、注意事项在微量离心管中添加反应成分是，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。2、注意事项所有的成分都加入后，离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约

8、 10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR 仪中进行反应。二、PCR实验流程3、结果分析DNA 在 260nm 的紫外线波段有一这一特点进行 DNA 含量的测定。二、PCR实验流程3、结果分析DNA 在 260nm 的紫外线波段有一这一特点进行 DNA 含量的测定。吸收峰，可以利用吸收峰，可以利用7二、PCR实验流程3、结果分析具体方法如下：将样品进行 50 倍稀释：取2L反应液至98L蒸馏水中以蒸馏水作为空白对照，在波长 260nm 处，将紫外分光光度计的读数调节至零；加入步骤 1 中的 DNA 稀释液 100L 至比色杯中，测定 260nm 处的光吸收值；根据下面的公式计算 DNA

9、含量：DNA 含量（g/mL）=50*(260nm 的读数)稀释倍数二、PCR实验流程3、结果分析紫外分光光度计三、PCR的应用三、PCR的应用拓展1：DNA技术：PCR能以极少量的DNA为模板,在几小时内 DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难于对样品出上百万份的由于DNA中四种碱基排列顺序千变万化，使DNA具有多样性，而DNA的多样性使得每个细胞中的DNA具有特异性，因此DNA也可以像用于甄别一样用来识别，这种方法就是DNA技术。进行分析研究（如DNA方面。其它：检测,被广泛地应用于遗传疾病的、刑侦破案技术）、古生物学、克隆和DNA序列测定等各嫌疑人：可以在现场留下的

10、中提取DNA（从现场获得的一滴血液、一根毛发、中细胞里提取DNA），酶切后电泳获得DNA图谱，再和嫌疑人的DNA图谱突变、定性定量检测进行对照比较，如果完全一样或高度一致。基本就能断定这些就是嫌疑人，从而用于侦破。8三、PCR的应用三、PCR的应用拓展2：DNA分子杂交技术：拓展1：DNA技术：在含目的的DN段上用放射性同位素（或荧光分子）标记，以此作为探针，使探针与组DNA杂交，若显示出杂交带，就表明样品中含有目的。甄别嫌疑人亲子鉴定三、PCR的应用拓展2：DNA分子杂交技术：【例5】PCR（多聚酶链式反应）技术是一项在生物体外特定的DN是（段的核酸）技术，如图表示过程下列说法错误的在含目的

11、的DN段上用放射性同位素（或荧光分子）标记，组DNA杂交，若显示出杂交带，就表以此作为探针，使探针与明样品中含有目的。9【例5】PCR（多聚酶链式反应）技术是一项在生物体外【例6】下列关于 PCR 技术应用的叙述，不正确的是特定的DNA片段的核酸）技术，如图表示过程下列说法错误的是（ A B生物 C D）检测患者血液中胰岛素的含量A B加 C甲过程高温使 DNA 变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用丙过程用到的酶在高温下失活，因此在PCR 扩增时需要再添在同一反应体系里加入多对特异性引物以同时检测多种病原微检测患者的血液中的含量发生突变的位点进行检测如果把模板 DNA 的两条链用15N 标记，游

12、离的脱氧核苷酸不对编码凝血因子的做标记，循环 3 次后，在形成的子代 DNA 中含有15N 标记的 DNA占 25%D PCR 中由碱基错配引起的变异属于突变【例8】（多选）聚合酶链式反应（PCR）在法医学中得到普遍应用，主要【例10】（2011 江苏）请回答工程方面的有关问题：是因为该技术（）（1）利用 PCR 技术扩增目的，其原理与细胞内 DNA类似(如下图所示)。图中引物为单链 DN。段，它是子链延伸的基础A灵敏度高 B需要的目标DNA 量少 C反应时间短D不需要特定序列的引物10【例10】（2011 江苏）请回答【例10】（2）设计引物是 PCR 技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。工程方面的有关问题：从理论上推测，