酶工程原理及应用-02 酶的生物合成及发酵生产

1、酶工程(原理及应用)郑穗平第二章 酶的生物合成及发酵生产一、酶的生物合成根本原理二、常见的酶生物合成体系三、酶发酵工艺控制酶的生产方法提取别离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemical synthesis)SOD - bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cellAmylase from BacillusProtease from BacillusPhosphatase from BacillusGlucoamylase from AspergillusPlant cell cult

2、ureAnimal cell cultureFew example天然菌种大规模发酵基因克隆重组工程菌分子生物学重组体系构建发酵工艺选择优化发酵工艺选择优化自然界快速筛选一、酶的生物合成根本原理Reverse transcription1、中心法那么-Central Dogma Replication 复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。Transcription 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原那么将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。Translation 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码

3、解读成蛋白质的AA顺序的过程。Reverse translation 逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。2、RNA的生物合成(转录)细胞内RNA的生物功能(1) 在某些RNA病毒中，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。 (2) 在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体核糖体，作为蛋白质生物合成的场所。(3) 某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条

4、件下，可以催化有关的生化反响。(4) 各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。转录过程的特点1、转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。反义链 antisense strand无意义链，负链：在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。有义链 coding strand编码链，正链：在RNA的转录中，不作为模板的DNA链称为有义链。2、转录所需酶：依赖DNA的RNA聚合酶又称为转录酶，是以DNA为模板的一类RNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由1种RNA聚合酶催化所有RNA的

5、生物合成。而在真核生物中RNA聚合酶有3种，分别为RNA聚合酶、RNA聚合酶和RNA聚合酶，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为410个，亚基种类有46种。 转录过程起始位点的识别 recognition转录起始 initiation链的延伸 elongation转录终止 termination转录后加工 modificationThe E. coli RNA polymerase holoenzyme consists of six subunits: a2bb s.Possible catalytic subunitsPromoterspecificityEnzyme assembly,pro

6、moter recognition,activator bindingRole unknown(not needed in vitro)36.5 kDa15115511 kDa(32-90 kDa)3、蛋白质的合成(翻译)翻译: 以RNA中mRNA为模板,按照其核苷酸顺序所组成的密码指导蛋白质的合成的过程.mRNA蛋白质翻译 各种信息 各种蛋白质核苷酸排列顺序 氨基酸排列顺序基因在原核和真核细胞中最终得到表达原核真核原料氨基酸，20种mRNA是合成蛋白质的“蓝图或模板tRNA是原料氨基酸的“搬运工rRNA与多种蛋白质结合成核糖体,作为合成多肽链的“装配机操作台(1)蛋白质的翻译系统蛋白质翻译系

7、统示意图mRNA是遗传信息的载体载有遗传密码，genetic code，是合成蛋白质的蓝图模板，它以一系列三联体密码子codon的形式从DNA转录了遗传信息。每个密码子代表一个氨基酸。mRNA占细胞总RNA的5-10%，不稳定，寿命短。原核的mRNA 是多顺反子;真核的mRNA 是单顺反子。信使RNA (mRNA)遗传密码上世纪60年代，利用均聚核苷酸实验，破译了遗传密码。遗传密码为三联体每三个碱基代表一个氨基酸，由5到3阅读，无间断。即使在少数重叠基因如病毒中，其开放阅读框架open reading frame, ORF仍按此原那么。起始密码为AUG, 终止密码为UAA，UAG和UGA。 5

8、AUG CCA UGC ACC CGG GUU .CAA UAG 3 Pro Cys Thr Arg Val .Gln 密码有简并性degeneracy，即一个氨基酸可由几个密码子表示；通用性，大多数生物使用同样的遗传密码，但也会有所偏爱。 原核tRNA有30-40种，真核有50-60种，含70-90个核苷酸， 并有多种稀有碱基。tRNA是最小的RNA， 占细胞总RNA 的15%左右，其功能是搬运氨基酸和解读密码子。tRNA 具有“四环一臂和“三叶草 形的典型结构。注意：3端CCA氨基酸受位和反密码子环转运RNA (tRNA)tRNA的结构“四环一臂 倒L形的三级结构 酪553A U GG U

9、 U U A C A C A酪氨酰- tRNA反密码mRNA密码(codon)与反密码(anticodon)的碱基配对tRNA的功能是解读mRNA上的密码子和搬运氨基酸。tRNA上至少有4 个位点与多肽链合成有关：即3CCA氨基酸接受位点、氨基酰-tRNA合成酶识别位点、核糖体识别位点和反密码子位点。每一个氨基酸有其相应的tRNA携带, 氨基酸的羧基与tRNA的 3 CCA-OH 以酯键结合。而tRNA的反密码子可以与mRNA上相应的密码子互补结合, 以使氨基酸正确“对号入座 因为密码子的序列对应于多肽链上 的氨基酸序列。变偶性或摆动性反密码子5端的碱基与 密码子的第三位配对不严格核糖体是rR

10、NA 与几十种蛋白质的复合体，有大、小两个亚基构成。含有合成蛋白质多肽链所必需的酶、起始因子IF、延伸因子EF、释放因子RF等。rRNA只有4-5种，但占细胞RNA 的大局部 。原核的核糖体70S= 30S小亚基 + 50S大亚基30S小亚基: 16S rRNA + 21种蛋白质50S大亚基: 23S，5SrRNA + 34种蛋白质真核的核糖体80S= 40S小亚基 + 60S大亚基40S 小亚基: 18S rRNA + 33种蛋白质60S 大亚基: 28S，5.8S，5SrRNA + 45种蛋白质核糖体ribosome与核糖体rRNA图为原核生物的两种RNA: 16S rRNA和5S rRN

11、A 的结构核糖体的结构核糖体有4个根本功能1. 容纳mRNA，并能沿着mRNA由5-3 移动，由tRNA解读其密码；2. 氨基酰位点A位点，可结合氨基酰-tRNAAA-tRNA；3. 肽酰基位点P位点，可结合肽酰基-tRNA肽-tRNA；4. 脱氨基酰tRNA的出口位(E位点) ;5. 肽酰基转移酶中心，是形成肽键的位点等。肽链合成的起始 initiation肽链合成的延伸 elongation肽链合成的终止与释放 termination and release合成多肽的输送和加工 transport and modification蛋白质分子的折叠 folding(2)蛋白质的生物合成过程氨

12、基酸活化生成氨酰-tRNA 翻译起始时，第一个氨基酸一般是甲硫氨酸，其氨基要甲酰化成为甲酰甲硫氨酸，予以保护。甲酰FH4甲酰基MettRNAfmetfMet-tRNA合成酶fMet-tRNA氨基酸与tRNA的 连接方式原核生物肽链合成的起始阶段是在GTP和起始因子Initiation Factor的参与下，核糖体30 S亚基，fMet- tRNAF ，mRNA和50 S 亚基结合，组成起始复合物的过程。主要包括5个步骤：130 S亚基与起始因子IF3 结合；230 S亚基与mRNA结合，形成30 S-IF3-mRNA复合物；3fMet- tRNAF 与起始因子IF2以及GTP结合，生成fMet

13、- tRNAF -IF2-GTP；4在起始因子IF1的参与下，fMet- tRNAF-IF2-GTP与30 S-IF3-mRNA结合生成30 S起始复合物。在此30 S起始复合物中，fMet- tRNAF上的反密码子正好与mRNA上的起始密码子AUG结合；550 S亚基与上述30 S起始复合物结合，形成完整的70 S核糖体。同时放出IF1，IF2，IF3 ，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70 S核糖体形成时，fMet- tRNAF 位于70 S核糖体的“P位肽酰基位，而它的“A位氨酰基位是空位。 蛋白质合成起始 新的氨基酸-tRNA的进位依赖Tu-Ts因子和GTP的协助 氨酰基tRNA进

14、入A位 肽键的形成由肽酰基转移酶催化此酶具有核酶的活性肽键的形成原核生物肽链的延长 核糖体沿着mRNA 53方向移位，多肽链沿着N端向着C端延伸，须有EF-G因子和GTP参与，空载的tRNA从E位点离开进位转位成肽合成终止氨基酸进位，肽链形成和延伸，核糖体沿着mRNA的53方向移位，循环往复，新合成的肽链由N端向着C端不断延长，直至mRNA上出现终止密码，相应的肽链释放因子RF1对应UAA、UAG，RF2对应UAA、UGA占据A位。肽链的合成终止，并从核糖体上释放。核糖体大、小亚基解聚，并进入下一轮合成。高效率的蛋白质合成体系多个核糖体结合在同一条mRNA上，由53进行翻译，形成多核糖体pol

15、yribosome，以提高翻译的效率(3)多肽链的修饰和加工(1)N端修饰 原核生物修饰时是由肽甲酰基酶除去甲酰基，多数情况甲 硫氨酸也被氨肽酶除去，真核生物中甲硫氨酸那么全部被切除。(2)多肽链的水解切除 水解切除其中多余的肽段，使之折叠成为有活性的酶或蛋白质。如酶原激活(3)氨基酸侧链的修饰 氨基酸侧链的修饰包括羟化、羧化、甲基化及二硫链的形成等。(4)糖基化修饰 糖蛋白是细胞蛋白质组成的重要成分。它是在翻译后的肽链上以共 价键与单糖或寡聚糖连接而成。糖基化是在酶催化下进行的。分泌型蛋白质在翻译过程中通过信号肽协助转入内质网的机制 信号肽signal peptide是在新生的多肽链中，可被

16、细胞识别系统识别的特征性氨基酸序列，在蛋白质翻译过程中或翻译后的定位发挥引导的作用。蛋白质的空间结构如何形成？功能与结构如何统一？体外、体内的结构如何变化？蛋白质分子设计及蛋白质工程的需要生物信息学技术的应用越来越多的基因工程产物需要复性复活, 要求蛋白质折叠的理论及技术的指导。基因工程重组蛋白类产物必须要形成正确的折叠才能表现出功能和活性。蛋白质的折叠4、酶生物合成的调节 (regulation)基因水平的表达控制酶含量的调节操纵子operon：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。A BEX底物水平的调节酶水平的调节 酶活性的调节酶含量的调节酶的定位调节辅助因子调节生

17、长发育的不同时期外界环境变化酶合成与分解速度的变化基因表达调控产物调节细胞内酶的调控模式酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度。细胞根据自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含量，从而对各种生物化学过程进行调控。酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节。在细胞内，所合成的酶的种类及数量是由特殊的基因信息决定的。DNA所携带的酶蛋白遗传信息，需要通过转录和翻译而合成酶蛋白。在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中转录的调控占主导地位。因此，基因表达的调控主要在转录水平上进行。酶合成诱导的现象Jacob and Monod的工作： 分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶； -半乳糖苷

18、透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验： 1.大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成； 2.大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶根本消失； 3.说明菌体生物合成的经济原那么：需要时才合成。 本世纪三十年代，H.Karstrom在对糖代谢过程中的某些酶的合成进行研究时提出：诱导酶与组成酶某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的诱导。能诱导酶合成的物质叫诱导物。被诱导合成的酶叫诱导酶。酶合成阻遏的现象Jacob and Monod的工作：实验： 1.大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的

19、培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； 2.在上述培养基中参加色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 3.说明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，表达了菌生长的经济原那么：不需要就不合成。某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的阻遏。能阻遏酶合成的物质叫辅阻遏物。被辅阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。乳糖操纵子的结构诱导机制调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物trp代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达色氨

20、酸操纵子酶的阻遏 -阻遏物和操纵基因的调节色氨酸操纵子的其他调控模式细菌通过弱化作用辅助了阻遏作用的缺乏，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始了的转录，那么只能通过弱化作用使它中途停顿下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少，而弱化作用的信号那么是细胞内载有色氨酸的tRNA，它通过前导肽的翻译来控制转录的进行。在细菌细胞内这两种方式的协同作用，表达了生物体内精密、高效的基因表达调控。 或者称为衰减子Itrp mRNA中能形成碱基配对四段序列，1-2配对，2-3配对和3-4配对。II当细胞中有色氨酸存在时，核糖体能够顺利地翻译出前导肽而在终止密码子UAG+70处停下来。这时核酸糖体占据了序

21、列1和局部序列2，使序列2和序列3不能产生有效配对，因而序列3和序列4配对而产生终止子和发夹结构。III当出现Trp饥饿时，核糖体停顿在两个Trp密码子上，这时核糖体占据序列1，序列2与序列3配对。这样，当序列4转录出来后仍呈单链状态，不能形成终止的发夹结构，于是转录继续进行下去。 细菌演化出衰减子调控系统的生物学意义?除了Trp操纵子外，其他许多负责氨基酸的操纵子都受衰减子的调控，其生物学意义可能是：活性阻遏物和非活性阻遏物的转变可能较慢，而tRNA荷载与否可能更为灵敏；氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而以tRNA荷载情况为标准来进行控制可能更为恰当；为什么大多数操纵子又同时需要阻遏蛋白呢？

22、因为衰减子系统需要先转录出前导肽mRNA，然后根据前导肽的翻译情况来决定mRNA是否继续转录，而当氨基酸含量丰富时，那么无需转录而关闭mRNA的转录活性。也就是说，需要一个决定根底水平的控制系统，当细胞内氨基酸高于某一水平时，可通过阻遏蛋白，而只有低于这一水平时，才需要用衰减子进行精细调节。细菌乳糖操纵子的作用机制(降解物阻遏)调节基因启动子操纵基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP复合物mRNA当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，那么cAMP的浓度降低， CAP-cAMP复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。+过去称葡萄糖效应二、常见的酶

23、生物合成体系非重组体系重组体系无细胞蛋白合成体系对产酶微生物的根本要求 根本要求：不是致病菌发酵周期短,产酶量高不易变异退化最好是产生胞外酶的菌种,利于别离。对医药和食品用酶,还应考虑平安性：凡从可食局部或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,平安!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。1非重组体系野生型或传统方法诱变筛选常用的产酶微生物Escherichia coli Pseudomonas Bacillus subtilis Micrococcus Streptococcus StreptomycesAspergillus ni

24、gerAspergillus oryzaeMonascusPenicilliumTrichoderma Rhizopus Mucor Absidia Saccharomyces cerevisiae Candida1、样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品2、富集培养: 投其所好，取其所抗 3、别离获得微生物的纯培养pure culture。4、初筛：选出产酶菌种，以多为主。5、复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。 产酶微生物的别离和筛选诱变育种 原生质体融合育种 基因工程育种 产酶微生物的选育 -淀粉酶的筛选蛋白酶产生菌的获得方法应用含酪蛋白的培养基大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆

25、菌，是最为著名的原核生物。形态：短杆或长杆状，0.51.01.03.0 um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。应用：大肠杆菌能作为宿主，最早用作基因工程的宿主菌工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和 制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等醋酸杆菌Acetobacter 菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动周毛或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好

26、。应用：有机酸(食醋等葡萄糖异构酶(高果糖浆 )山梨糖 (维C中间体 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.51.51.8m，中生或近中生。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。Bacillus subtilisASI.398Bacillus subtilisBF7658生产蛋白酶生产淀粉酶根霉(Rhizopus) 分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。 根霉因有假根Rhizoid而得名假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养。分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起

27、霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。代表种：米根霉R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。曲霉(Aspergillus) 分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。代表种：黑曲霉Asp. Niger、黄曲霉Asp.flavus应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂蛋白酶、淀粉酶、果胶酶的菌种。生产有机酸如柠檬酸、葡萄糖酸等。农业上用作生产

28、糖化饲料的菌种。2重组体系原核表达体系真核表达体系当外源基因引入某宿主细胞表达时，应考虑以下各种因素： 外源基因的启动子顺序能否在宿主细胞起作用利用表达载体对转录产物能否进行加工修饰利用cDNA3. 转录产物的稳定性4. 转录产物的核糖体识别顺序能否为宿主细胞的翻译系统所识别利用表达载体的基因融合技术5. 密码子的使用频率选用适当宿主细胞6. 翻译产物的后修饰 选用适当宿主细胞 翻译产物的稳定性 外源基因产物对宿主是否有害外源基因产物产量选用不同拷贝数的载体外源基因的最终产物是否具有生物活性选用适当宿主细胞11. 外源基因的稳定性改变宿主细胞遗传特性，如将外源基因插入染色体12. 对于制备大量

29、外源基因产物，还须考虑到表达产物与其它细胞成分的别离方法最正确的基因表达体系： 目的基因的表达产量高; 表达产物稳定; 生物活性高; 表达产物容易别离纯化。基因的表达系统与表达策略宿主细胞的选择适合目的基因表达的宿主细胞的要求: 1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等； 大肠杆菌系统: 融合表达和直接表达小于80AAs的多肽

30、可用融合表达系统, 分子量在100-300AAs 且无过多半胱氨酸的多肽可用直接表达pET(plasmid for expression by T7 RNA polymerase), pTrcHis系列载体2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 酵母表达系统:酿酒酵母和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)系统，直接表达和分泌表达； 昆虫杆状病毒表达系统：直接表达和分泌表达 哺乳动物细胞表达系统：瞬时表达和稳定表达: 非微生物来源的大于500AAs的分泌蛋白质和外表受体蛋白原核生物基因的特点：1、原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。 2、

31、原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。3、一般不含内含子intron，没有转录及翻译后加工系统。4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：1、删除内含子和5非编码区2、外源基因置于强启动子和SD顺序控制下3、维持正确开放阅读框架ORF4、mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解。优越性：对大肠杆菌的根底生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。有各类菌株和载体系列。目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质

32、表达等。易培养，本钱低。缺点：大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。因分泌能力缺乏，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。其内毒素很难除去。 大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。大肠杆菌碱性磷酸酶AKP基因的克隆表达主要步骤培养基及试剂配制含pET-Blue质粒细菌的培养pET-Blue质粒的提取质粒DNA的琼脂糖电泳及紫外吸收分析大肠杆菌的培养大肠杆菌基因组DNA提取PCR扩增AKP基因琼脂糖凝胶电泳分析及PCR产物纯化质粒DNA与目的DNA的双酶切酶切产物的纯化质粒DNA与目

33、的DNA的连接感受态细胞的制备重组质粒的转化重组子的筛选及鉴定重组子的发酵培养重组蛋白质的检测及别离纯化R3510SD编码序列OriTcrTT启动子起始密码子AUG、GUG、UUG终止密码子UAAU、UGA、UAG大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。大肠杆菌表达载体的成份大肠杆菌表达载体的成份启动子：要求是：强启动子是诱导性的，如热诱导和化学诱导。转录终止子：使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水平。尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。核糖体结合位点：在转录起始位点下游的一段D

34、NA序列SD，5AGGAGG3(4)筛选标记基因(5)密码子的选择常见的大肠杆菌表达系统T7表达系统T7噬菌RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。Lac表达系统是-半乳糖苷酶编码基因LacZ的转录的调控序列，该启动子可以被IPTG诱导，所以在培养基中参加该抚慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导表达。PL表达系统是负责DNA分子转录的启动子之一，是一种极强的启动子。影响克隆基因表达效率的因素一般而言，所用启动子的强度、DNA的转录起始

35、序列、密码子的选择、mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。启动子的结构对表达效率的影响大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即-10区(位于转录其始位点上游5-10bp，故称为-10区，序列为5-TATAAT)和-35区(位于转录起始位点上游25bp处，一般有10bp组成， 5- TTGACA故称为-35区，)。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究说明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于17bp，启动子的活性

36、就越强。b. 翻译起始序列对表达效率的影响mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子AUG和其上游的SD序列。所谓SD序列就是由Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。一般SD序列的长度约为3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体RNA的3端互补，控制了翻译的起始。-AGGAGGUXXXAUG mRNAAUUCCUCCACUAG16S rRNA3 末端c. 启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响研究说明启动子和目的基因间的距离对基因

37、的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这一因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否那么会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。PromoterSDAUGGeneTerminatorUAAmRNA表达类型：融合型表达载体：融合蛋白非融合型表达载体：-天然完整蛋白分泌型表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙 融合型表达载体 PSDForeign DNA融合型表达载体融合基因非融合型表达载体 PSDForeign DNA非融合型表达载体非融合基因蛋白质的融合表达融合表达一般是将基因引入某表达载体编码的高表达蛋白担体蛋白序列的

38、3末端。表达出来的融合蛋白的N末端含有由担体序列编码的片段。融合蛋白可以直接用作抗体，但通常是将N端的担体蛋白局部从C端的目的蛋白中裂解出来，有利于对目的蛋白进行生化研究及功能分析。方法主要有：化学裂解法和酶解法。蛋白质的分泌型表达将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游有可能实现分泌表达。实现蛋白质分泌表达有许多有利之处：1.在穿膜过程中信号肽被信号肽酶切除。生产的蛋白质和天然蛋白质是一致的。2.周质中蛋白酶活性低，分泌的蛋白稳定。3.周质中细菌的蛋白很少，使得重组蛋白易纯化。4.周质中提供了一个氧化环境，更有利于二硫键的正确形成。因此，对于许多难以纯化的蛋白质可以通过分泌表达来实现生产

39、。蛋白质的包含体形式表达重组蛋白在大肠杆菌中高表达时，绝大多数是以包含体形式存在的。包含体就是表达的蛋白质在细胞内聚集成没有生物活性的固体颗粒。不可溶、无生物活性的包含体必需经过变性、复性才能获得天然结构及生物活性。减少包含体形成的策略：1.降低重组菌的生长温度。2.添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂。如高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖。3.供给丰富的培养基，创造最正确培养条件，如供氧、pH值等。不过，包含体的形成有时也是有利的，不仅可以获得高表达、高纯度的蛋白质，还可防止细胞水解酶对重组蛋白的破坏。有效、理想的复性方法应具备以下几个特点：1.活性蛋白质的回收率高。2.正确复性的产物易于

40、与错误折叠蛋白质别离。3.折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。4.折叠复性方法利用放大。5.复性过程耗时较少。真核基因表达的特点1、一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；2、基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；3、mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；4、基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。原核体系中表达真核基因的困难细菌的RNA聚合酶不识别真

41、核基因的启动子；真核基因转录的mRNA在原核细胞中不能结合到核糖体上；真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子局部不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以防止被原核蛋白酶的

42、识别和降解，最后可以将融合多肽切除。构建表达载体的策略真核表达系统酵母丝状真菌昆虫哺乳动物细胞转基因动物植物反响器酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。大肠杆菌表达系统的缺陷：1.缺失真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等。2.表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和生物活性。因此，可以使用真核生物酵母作为表达菌。如酿酒酵母、甲醇酵母等。酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。酵母表达系统的优缺点遗传背景清楚基因组是大肠

43、杆菌的3.5倍增殖快90min/代，培养容易，产量较高易于研究突变与基因功能，如构建酵母人工染色体等可以进行转录和翻译后修饰加工提纯工艺复杂，本钱高，制品纯度达不到要求，制品免疫原性差，接种剂量大酵母载体的根本结构DNA复制起始区：2质粒和自主复制序列选择标记：营养缺陷型和显性选择抗药整合介导区：同源重组，决定整合位置和拷贝数有丝分裂稳定区：帮助载体平均分配表达盒转录启动子终止子分泌信号序列酵母表达系统中载体的种类按载体在酵母中的复制形式分为：YIp：酵母整合型载体YRp：酵母自主复制型载体YCp：酵母含着丝粒片段载体YEp：酵母附加体型载体YAC：酵母人工染色体微观的酵母细胞表102 甲醇酵

44、母表达系统甲醇酵母能利用甲醇为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是甲醇在乙醇氧化酶作用下氧化成甲醛，乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱，因此甲醇酵母代偿性的大量产生这种酶。调控乙醇氧化酶的启动子是强启动子，可用来调控异源蛋白的表达。优点：1.具有强启动子，可严风格控目的蛋白的表达。2.可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性。3.营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产。4.可高密度发酵培养。影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素1.目的基因的特性2.表达框的染色体整合位点与基因拷贝数3.宿主的甲醇利用表型4.分泌信号5.产物稳定性6.翻译后修饰5AOX1 启动子片段含有AOX

45、1启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达； -因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化； 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点； TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号； HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3 AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同源重组； 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表达载体在E.coli中筛选和复制。毕赤酵母表达系统中常用载体的根本结构pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点1. 载体的3 AOX1区与基因组的AOX1基因的末端发生整合重组表达载体与毕赤酵母基因组发生重组的

46、两种方式：2. 载体的HIS4区与基因组的HIS4基因的末端发生整合重组图10-12 图示: 巴斯德毕赤酵母中乙型肝炎外表抗原的表达图1013 甲醇酵母系统高效表达影响因素载体稳定性：是整合还是粘附到酵母染色体上基因剂量：单/多拷贝甲醇利用表型：Muts(利用甲醇慢型)， Mut+ (利用甲醇快型)mRNA5端：应尽量防止在UTR区出现AUG和次级结构AT含量：AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构表达产物稳定性：分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素外源基因的3末端的最低自由能稳定性对于实现目的基因在毕赤酵母中成功高效表达是比较重要的因素，汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课

47、题组联合北京军事医学科学院李伍举教授课题组建立了一个针对pPIC9表达载体在毕赤酵母中高效表达的数学模型。外源基因在毕赤酵母表达系统中高效表达预测的网页效劳器 分析流程：在“sequence方框中输入由目的基因末端100bp及其后面的载体100bp组成的200bp序列片段； 点击底下的“Evaluation按钮，在“Evaluation方框中显示预测的结果；如果结果显示低于0.5，那么可点击“Design这个按钮，那么显示根据密码子使用改造后的序列。昆虫表达系统杆状病毒基因组：闭环双链DNA，88-166kb启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启动子表达系统杆状病毒表达系统BEVS家蚕核

48、型多角体病毒-家蚕表达系统宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅目、毛翅目的600多种昆虫克隆基因方法：转移载体共转染同源重组空斑筛选纯化重组病毒杆状病毒表达系统优点容量大：能插入12kb的外源基因高表达：polh基因启动子是目前所知的最强的真核启动子；产物对宿主影响小；产物可结晶高效：可同时表达多个基因平安：杆状病毒对脊椎动物无病原性具加工修饰功能：昆虫细胞较高等家蚕易饲养哺乳动物细胞表达表达系统常用宿主细胞哺乳动物细胞常用载体真核细胞表达元件哺乳动物基因转移的遗传标记基因表达的检测方法哺乳动物细胞表达的优点重组DNA易转染，遗传稳定，可重复识别和去除内含子进行翻译后修饰磷酸化、

49、糖基化、二硫键、寡聚体等的形成、高级结构的正确折叠产品的构型正确率高，可被改造成类人体源性，免疫源性好可分泌至培养基，提纯工艺简单，本钱低可用于基因治疗常用宿主细胞细胞名称来源已投放产品BHK-21地鼠幼鼠肾凝血因子CHO-K1中国仓鼠卵巢tPA，因子，EPO，G-CSF等C127小鼠乳腺肿瘤GHMDCK长耳狗肾脏兽用疫苗NamalwaBurkitt淋巴瘤病人的类淋巴母细胞EPO，LT，tPA，IFNVero成年非洲绿猴肾HBsAg，GH鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤tPA，抗体COSSV40转化的绿猴肾细胞CD34，CD69，TGF3无细胞体外蛋白质合成体系原核表达体系真核表达体系 无细胞体外蛋白质合成

50、体系In vitro cell free translation or protein synthesis system是一种细胞裂解物，这种系统只有翻译功能，当参加外源mRNA，能量物质和氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经SDSPAGE后可检测出翻译活性。 常用翻译系统有以下几种： 1. 兔网织细胞裂解物(reticylocyte lysate system) 由未成熟的兔红细胞裂解而成，该种细胞是向动物注射苯肼后引起贫血产生的,向该系统参加血红素基和能量物质，裂解物中的内源mRNA可被翻译成球蛋白 ，其合成速度与用完整细胞的合成速度接近。 微球菌核酸酶可除去内源mRNA，同时也不会对系统中的

51、tRNA和rRNA 损伤过大。由于该核酸酶的活性依赖于Ca2+，当除去内源mRNA后，可用EGTA除去Ca2+，此系统仍可保持70%的活性。 因该系统无内源核酸酶和蛋白酶，可用于大分子mRNA 的翻译。 2.小麦胚抽提物(wheat germ extract) 该系统不具内源mRNA，属外源mRNA 依赖型，利用Sephadex-G50可减少该系统中的内源氨基酸，因而可大大增加翻译产物的高比活性。 由于该系统存在着核酸酶和蛋白酶，因此不能用于翻译很大的mRNA ，该系统仅为前一系统活性的1/10。 3.其它系统： 鼠骨髓瘤抽提物，艾氏腹水瘤和酿酒酵母裂解物等。 4.两栖动物卵母细胞: 翻译效率

52、高，翻译产物稳定，灵敏度高10ng mRNA ，也可作为转录翻译系统。三、酶的发酵工艺条件与控制 The fermentation principles and its control of enzyme production培养基发酵条件控制提高产酶的措施典型的植酸酶发酵生产工艺酶发酵工艺组成局部培养基制备 种子培养发酵罐产物的提取精制无菌空气生长和产酶、经济、高转化纯种、高生长率无菌、高溶氧、均匀混合多相系统传质传热培养条件维持高密度发酵、产酶经济、高收率控制点Medium and InoculationAgitationCooling and heatingAir inlet and o

53、utletpH controlVolume control一般性工艺条件Nutrient additionProtein biosynthesisInductionRepressionExcretionGene stability特殊工艺条件发酵工艺控制Process control and monitoring发酵参数控制Sugar consumptionpHTemperatureFermentation time (h)AgitationCell Dry WeightProductComputer softwares have been developed to monitor and c

54、hange the process on line1、选择适宜的营养物质2、营养物的浓度及配比适宜3、物理、化学条件适宜4、经济节约5、精心设计、试验比较培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；不同阶段，培养条件也有所差异。培养基的设计原那么1、培养基五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的根底培养基medium是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素构成细胞物质或代谢产物中碳架 碳源可作能源，为生命活动提供能量常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、

55、烃类、蛋白质及其降解物异养微生物：糖类是最好碳源葡萄糖最为通用 水是微生物最根本的组成分水是微生物体内和体外的溶剂吸收营养成分和代谢废物水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定比热高，传热快水碳源选择适宜碳源，以适应目的酶的合成调节机制构成细胞物质和代谢产物中氮素不能用作能源 氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源铵盐、硝酸盐 参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压控制细胞的氧化复原电位有时可作某些微生物生长的能源物质 常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。 氮源无机盐需要注意适宜的碳氮比生长因子

56、生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外参加少量的生长需求的有机物质。 分类：化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物和类脂成分 等四类功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反响 实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子 工业规模中通常由有机氮源辅助提供实验室的常用培养基：细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基或简称普通肉汤培养基；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌： 查氏合成培养基；例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或LB培养基；自然转化：根底培养基；观察芽孢：生孢子培

57、养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；枯草杆菌BF7658-淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠 0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%自然pH。枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%, 糠1%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%自然pH。黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%pH4.45.0。地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉5.5%, 豆饼4%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。黑曲霉AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基: 玉米

58、粉6%, 豆饼粉4%, 玉米浆0.6%, 氯化钙0.5%, 氯化铵1%, 磷酸氢二钠0.2% (pH 5.5)。 游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05% (pH 7.2)。桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%, 硫酸镁0.05%, 氯化钙0.04%, 磷酸氢二钠0.05%, 磷酸二氢钾0.05% (自然pH)。黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基: 麸皮5%, 果胶0.3%, 硫酸铵2%, 磷酸二氢钾0.25%, 硫酸镁0.05%, 硝酸钠0.02%, 硫酸亚铁0.001% (自然pH)。枯草杆菌AS1.398碱性磷酸

59、酶发酵培养基: 葡萄糖0.4%, 乳蛋白水解物0.1%, 硫酸铵1%, 氯化钾0.1%, 氯化钙0.1mmol/L, 氯化镁1.0mmol/L, 磷酸氢二钠20mol/L ( 用pH7.4的Tris-HCl缓冲液配制)1. 固态发酵法微生物的培养物是固态，一般使用麸皮作为培养基。在曲房内将培养基拌入种曲后固态，含水量60左右铺成薄层1cm左右在曲盘或帘子上，然后置于多层架子上进行微生物的培养。培养过程中控制曲房的温度和湿度90100，逐日测定酶活力的消长，待菌丝布满基质、酶活力到达最大值不再增加时，即可终止培养，进行酶的提取。固态培养法一般适用于霉菌的生产。起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术

60、，生产简单易行，但劳动强度高。近年新开展了通风制曲工艺，在酶制剂的生产中仍占有重要作用。2、典型的酶制剂发酵工艺2. 深层液体培养法采用在通风搅拌的发酵罐中进行微生物深层液体培养，是目前酶制剂发酵生产中最广泛应用的方法。液体深层发酵法的优点机械化程度高，发酵条件易控制。酶的产率高、质量好。培养的无菌要求高，在生产上要特别注意防止染菌。微生物酶制剂生产工艺举例淀粉酶生产工艺菌种微生物培养法微生物培养条件细菌液体深层发酵中性至微碱性霉菌固体曲法微酸性一般在酶活到达最顶峰时结束发酵，离心以硅藻土作为助滤剂去除菌体及不溶物。在钙离子存在下低温真空浓缩后，参加防腐剂、稳定剂以及缓冲剂后就成为成品。为制造