毒理学基础：第六章 外源化学物的一般毒性作用

1、第六章 外源化学物的一般毒性作用第一节 概述第二节 急性毒性作用第二节 局部毒性作用 第四节 短期、亚慢性和慢性毒性作用一、 一般毒性作用和意义：一般毒性作用（general toxicity）也称基础毒性，是全身各系统对外源化学物的毒作用反应，是与特殊毒性（生殖毒性、致突变、致癌）相对应的概念。 根据接触毒物的时间长短，可分为：急性毒性急性毒性试验亚急性毒性亚急性毒性试验亚慢性毒性亚慢性毒性试验慢性毒性慢性毒性试验第一节 概述Page 3一般毒性评价和研究的主要目的：确定受试物毒作用的表现和性质确定受试物毒作用的剂量-反应（效应）关系确定毒作用的靶器官确定损害的可逆性。Page 4二、一般毒

2、性试验的动物选择和染毒方式（一）实验动物的选择实验动物（laboratory animal）指遗传背景明确，经人工培育，对其携带微生物实行控制，以科学研究为目的的动物。实验用动物（experimental animal）指一切能用于科学实验的动物。包括实验动物、野生动物、经济动物和观赏动物。1、物种： 选择对受试物敏感的物种 对受试物的吸收、代谢、生物化学和毒理学特征与人相 近的物种 自然寿命不太长的物种 经济并易于获得和饲养的物种。 通常选择两个物种，即啮齿类和非啮齿类各一种。 啮齿类（rodent species）：大、小鼠 小鼠：昆明种、NIH、ICR 非啮齿类（nonrodent sp

3、ecies）：犬或猴选择实验动物的基本原则大鼠：Sprague-Dawley（SD）、WistarA 研究气体或蒸汽对呼吸道的刺激作用，最好选猫。B 研究化学物质的致敏作用，最好选用豚鼠。常用动物对化学致 敏物致敏顺序如下：豚鼠家兔狗小白鼠猫；C 研究化学物质对实质性脏器的危害时，应选用小鼠、大鼠、家兔等；D 研究化学物经皮肤吸收作用常选用兔；对皮肤的刺激作用，最好用白色豚鼠或白色家兔，对眼的刺激以兔眼最敏感。E 猫狗用于以呕吐为指标的实验研究；草食动物如家兔、豚鼠不产生呕吐反应。根据实验研究目的选择实验动物F 大鼠、家兔、狗易建立高血压病理模型，适于研究能致血压变化的实验；G 研究外界环境对

4、体温的影响时，宜选用兔及猫，而小鼠、大鼠因体温调节极不稳定，故不适用。另外狗无汗腺，也不能用；H 遗传毒理学试验多用小鼠，致癌试验常用大鼠和小鼠，致畸试验常用大鼠、小鼠和兔。迟发性神经毒性试验常用母鸡。I 测定半数致死量（或浓度）常用小鼠或大鼠，因为它们易繁殖，经济、方便。 J 猫、狗也用于急性毒性试验，但因价贵不易于大量使用。K 猪为杂食动物，对一些化合物的生物效应表现与人有相似之处，尤其是皮肤结构与人较近似。但因体大、价贵，不便大量使用。Page 83. 级别： 应使用级（清洁级）或级以上的动物，以保证实验结果的可靠性。4. 性别：雌雄各半如雌、雄动物毒效应有明显差异，则将雌性和雄性动物的

5、实验结果分别进行统计分析如已知动物对受试物的敏感性有性别差异，则应选择敏感的性别2. 品系 对某种外源化学物的毒理学系列研究应固定使用同一品系的动物，以求研究结果的稳定性和可比性。小鼠： 18 25 g大鼠：180 240 g豚鼠：200 250 g家兔： 2 2.5 kg 猫： 1.5 2.0 kg5. 年龄和体重急性毒性试验：选择刚成年、健康、未曾交配和受孕的动物亚慢性和慢性毒性试验：选择较幼年的或刚断乳的动物，以观察受试物对生长发育的影响，并使实验周期能覆盖成年。同一试验中，相同性别的动物的起始体重差异不应超过平均体重的20%Page 106. 生理和健康状况健康：实验动物的预检给药前检

6、疫观察大、小鼠、兔、豚鼠1周，犬猴2 3周适应新环境，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响筛检健康状况不符合试验要求的动物 对于大鼠和犬的亚慢性和慢性试验，可在实验前采血进行血液学和血生化检查，剔除异常动物。 犬应在试验前常规驱除肠道寄生虫。雌性动物：未产未育的动物雄性动物：未曾交配实验动物的给药前禁食处理经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰大、小鼠隔夜禁食，正常给水，染毒2 h后提供饲料经口多次染毒可不禁食 实验动物喂养环境室温控制在22 3，相对湿度40% 70%，无对流风。每笼动物数以不干扰动物个体活动及不影响试验观察为度，必要时需单笼饲养。饲

7、养室采光照12小时，一般食用常规试验室饲料，自由饮水。 （二）受试物及处理 1. 严格保证受试物质量： 了解受试物的化学结构、纯度、杂质成分、理化性质； 了解试验需要的总量；采用同一批号为宜，成分和配方不变； 受试物在贮存、保管、配制需注意稳定、均匀。 2配制受试物的常用水溶液（蒸馏水或去离子水）、混悬液 （0.5%羧甲基纤维素钠、10%阿拉伯乳胶）、油溶液（玉米油、橄榄油）。一般采用临用前配制。（三）实验动物染毒方式 1. 经口（消化道）染毒：灌胃法、喂饲法、胶囊法（犬和兔）2. 经呼吸道接触： 吸入染毒（静式吸入、动式吸入）和气管注入3. 经皮肤接触： 小鼠或大鼠的浸尾试验、皮肤斑贴法或兔

8、耳法4. 注射途径接触：静脉、腹腔、肌肉、皮下注射灌胃静式吸入染毒方法：一定体积的密闭容器，加入易挥发的液态或气态受试物染毒柜体积、动物数、时间，依据实验动物最低需气量计算优点：简单、方便、受试物消耗少，适合于小鼠缺点：氧气减少，浓度不稳定，经皮吸收，不适合稍大动物，挥发性不强的受试物用此法受限动式吸入染毒有空气流动的染毒柜，新鲜空气不断流入，污染空气不断流出。温度、湿度、氧及二氧化碳分压相对恒定，并有随时补充受试物，维持浓度稳定。可采样监测受试物浓度，可持续接触受试物，无时间限制 组成：染毒柜、机械通风系统、 配气系统优点：受试物浓度和氧分压比较 稳定缺点：设备要求高，消耗受试物 量很大，操

9、作比较复杂， 费时费工静式吸入染毒动式吸入染毒设备A 整体暴露 B 口鼻暴露实验动物最低需气量及不同体积染毒柜应放置动物数关系小 鼠大 鼠1.4510.183.4530.512 151 236 405 6动物种属呼吸通气量（L/小时）最低需气量（L/小时）不同容积染毒柜放置动物数（只）25 L50 L100 L300 L3 56 101皮肤接触静脉注射尾静脉小隐静脉耳缘静脉腹腔注射皮下注射 工业毒物：经呼吸道、皮肤 农用化学物：经口、皮肤、呼吸道 药品：经口、注射、皮肤 食品：经口 环境污染物：经口、呼吸道、皮肤 不同途径的吸收量和吸收速率吸收速率：静脉注射 呼吸道 肌肉注射 腹腔注射 皮下注

10、射 消化道 皮内注射 经皮染毒途径影响受试物毒性 染毒途径选择注意问题： 模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式； 利于不同化学物之间急性毒性大小的比较； 了解受试物的理化性质、实际用途及可能的毒作用； 满足各受试物评价程序的要求。第二节 急性毒性作用 急性毒性（acute toxicity）：是指机体（实验动物或人）一次接触或24小时内多次接触一定剂量外源化学物后在短期内所产生的健康损害作用及致死效应。接触次数：一次接触或24小时内多次（一般不超过3次，且有一定时间间隔，如灌胃应间隔4小时）毒效应出现时间：观察接触毒物后毒性症状出现的时间以及接触毒物的时间。观察时间：一般7 14

11、天，必要14天以上。Page 27毒效应强度：数分钟产生或瞬间死亡，几天、十几天出现（迟发），严重死亡。急性毒性试验（acute toxicity test）：是评价化学物的急性毒作用的试验，是了解和研究外源化学物对机体毒作用的第一步，在短期内可以获得许多有用的信息和资料。二、急性毒性试验的目的通过试验测定毒物的致死剂量以及其他急性毒性参数，其中最主要的参数为半数致死剂量（LD50），并根据LD50值进行急性毒性分级。 LD50：能引起50%动物死亡的受试物剂量。 其他以死亡为终点的急性参数： 绝对致死剂量（LD100）：能使所有实验动物死亡的最低剂量 最小致死剂量（MLD或LD0.1） ：能

12、使个别动物死亡的剂量 最大无致死剂量（MNLD或LD0）：未引起动物死亡的最大剂量 最大耐受剂量或浓度（MTD/MTC） ：已达到最大染毒剂量或浓度而未见动物死亡。以非致死性为终点的急性参数：急性毒性LOAEL和NOAEL Page 292. 通过观察动物中毒表现和死亡情况，初步评价受试物对 动物和人体产生损害的危险性大小和毒效应的特征、靶 器官和剂量-反应（效应）关系等。3. 为亚急性、亚慢性和慢性毒性试验以及其他毒理学研究 的染毒剂量设计和观察指标选择提供依据和建议。4. 为毒作用机制研究提供初步线索。三、急性毒性试验方法的要点：以经口急性毒性试验为例（一）经典的急性毒性试验（传统的LD5

13、0法） 实验动物的选择：首先大鼠，体重变异不超过平均体重的20%动物数量和性别：每组雌雄至少各使用5只动物，（大、小鼠通常每组10只，犬类6只）分组和剂量：至少3组，一般5-7组，限量实验剂量为2000 mg/kg；严格遵循随机化的原则。观察期和频率：至少14天，每天至少一次称重和解剖：染毒前、染毒后和每周及动物死亡时都要称重，所有动物均应进行大体尸体解剖，并记录观察到的全部病变。计算LD50：曲线拟合法（概率单位法）和插值法（包括寇氏法、改进寇氏法和霍恩法等） 急性毒性试验受试物染毒的量、按适宜容积染毒。 原则：毒性大的给较小量； 毒性低的需一次给较大的量，但不超过最大给药溶积。 推荐染毒最

14、大量： 经口20 ml/kg（对空腹动物）； 经皮2 ml/kg（据体表面积） 静脉1 ml/kg（5 min以上）； 肌内注射0.5 ml/kg（一个部位） 每眼0.01 ml； 直肠0.5 ml/kg； 阴道：大鼠0.2 ml，兔1 ml 吸入2 mg/L； 鼻：猴或犬每鼻孔0.1 ml（二）急性毒性替代试验： 遵循3R原则（即替代（replacement）、减少（reduction）和优化（refinement），开展实验动物的替代实验。常用的替代实验方法：限量试验（limit test）：如受试物毒性很低，可使用限量试验。限量试验实际上是传统方法的一种特例，并非真正的替代法。一般使用使

15、用啮齿类（大鼠或小鼠）20只，雌雄各半。经口灌胃剂量至少为10g/kg, 若不能达到 10g/kg ，则应给予动物最大剂量（最大可用浓度和最大灌胃体积 ）。染毒后连续观察14天，如动物无死亡，则认为受试物的LD50 大于此剂量；若动物死亡，则选择其他方法进一步测试。 2. 固定剂量法（fixed dose method） 与以往经典急性毒性方法不同点是它不以动物死亡作为观察终点，观察指标是明显毒性。此方法选定或固定的剂量范围是5、50、500 mg/kg，而最高限量是2000 mg/kg。 固定剂量法的预实验使用单性别1只动物循序进行，前后两只动物间隔至少24h。若1个剂量无中毒表现，其上一个

16、剂量动物死亡，则需要在其中间插入剂量。根据预实验结果进行正式试验，一般只需一个剂量、5只动物（包括预实验在该剂量水平做过的动物）。如果2000 mg/kg预实验和正式剂量都不出现中毒表现，试验终止。Page 34 欧共体（EEC）的急性经口毒性分级标准为：高毒（LD5025 mg/kg）有毒（LD50为25-200 mg/kg）有害（LD50为200-2000 mg/kg）不分级（LD502000 mg/kg）与经典实验法比较：（1）毒性分级：一致性为80.2%（2）毒性反应：两种方法无明显差异（3）实验所用动物数： LD50 经典毒性实验法平均每个化合物 用大鼠24.2只；固定剂量法平均用大

17、鼠14.8只。3. 急性毒性分级法（acute toxic class method） 以死亡为终点的分阶段试验法，每阶段3只动物，根据死亡动物数，平均经2 4阶段即可判定急性毒性。所用动物少，仍可得到可接受的结论，此法基于生物统计学。 急性毒性分级法应用啮齿类，首选大鼠。 依照固定的判别表格，每次选用设定剂量（5、50、300、2000mg/kg）之一，单性别3只动物进行试验，确定动物的生死后再进行下一步试验。Page 36有三种可能的结局：（1）不需进一步试验即可分级（2）下一步试验降低一档或升高一档剂量进行（3）下一步试验以相同剂量再做3只动物，根据结果决定是终止或升高或降低一档剂量。

18、动物观察14天，在染毒当天观察体征和死亡至少两次，之后每日观察一次。染毒前和每周测体重，所有动物均进行大体解剖，必要时进行组织病理学检查。 根据在某一染毒剂量下死亡的动物数来判定大致的LD50范围，直接进行毒性分级。Page 374. 上下法（up/down method）：根据受试物的初步资料确定第一只动物接受的剂量，观察48h，若不死亡，下一只提高一档剂量，若死亡就降一档剂量。但每一只存活动物都需观察到14天，后期死亡动物也计入统计结果。该法通常以死亡为终点， 适用于“全或无”的反应。 推荐采用的剂量（mg/kg)序列为：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000或5000

19、。 使用此方法选择的剂量应使大部分动物都在其平均致死剂量左右。 几种方法的比较：（1）急性毒性分级：上下法和经典法的一致性为23/25；上下法与固定剂量法的一致性为16/20；（2）试验用动物数：上下法仅需6-10只单性别动物，少于固定剂量法和急性毒性分级法。1. 观察期限一般为14天，也可根据毒性反应、症状发生的速度和恢复期长短而定，如有必要可适当延长观察期。2. 对于一些速死性化合物求其LD50（LC50）也可仅计算24 h的死亡率。有些速杀性化合物的24 h LD50与两周LD50值往往没有差别。但应注明是多少时间的LD50值，以便于在进行毒性比较时有共同的基础。3. 给予受试物后，应密

20、切观察各组实验动物的毒性反应情况。4. 在观察期间应保障实验动物有完全的膳食、充足的饮水及适宜的温湿度环境，以防止动物出现非中毒性死亡。（三）急性毒性作用观察5. 观察指标： 中毒症状重点观察记录发生每种中毒症状的时间、症状 表现程度、各症状发生发展的过程与规律及动 物死亡前特征和死亡时间 死亡情况重点观察记录每只动物出现死亡的时间，特别 是最早出现死亡的时间，各剂量组的死亡数。 分析动物死亡时间的规律，计算LD50。 体重及其他指标在观察期14天内需多次测量动物体重， 体重改变可以反映动物中毒后的整体变化。 大体解剖对死亡的动物应及时进行大体解剖，观察主要 脏器的大体病理变化。存活24 h以

21、上动物的肉眼 观察得到的病变组织、器官均需进一步作镜检。体重变化的原因影响食欲或消化系统的功能影响食物的吸收和利用影响水的摄取肾功能急性损伤 续表6-1 啮齿类动物急性中毒表现 LD50应用中有关问题以新药为例， LD50试验的意义在于： 标准化药物毒作用强度，评价药物对机体毒性的大小， 比较不同药物毒性的大小。 计算药物的治疗指数，药效剂量和毒性剂量的距离。 为后续的重复给药毒理学试验剂量的选择提供参考； 通过比较不同途径的LD50值，获得生物利用度的信息。 试验结果可用来推测人类的致死剂量以及中毒后的体 征，为临床毒副作用提供监测参考。LD50不是一个生物学常数，有局限性： 评价新药或化学

22、物时，给予有效的信息较少，实用性 有限。 波动性很大，影响因素多。 物种差异对其影响大。 经典急性试验消耗动物数量大。四、急性毒性分级 急性毒性试验求出LD50值，通过LD50值进行急性毒性分级（acute toxicity classification），评价毒物的急性毒性强弱，比较毒物的急性毒性的大小。 外来化合物的急性毒性分级标准用于对急性毒性进行评价。但各种分级标准还没有完全统一。我国目前除参考使用国际上几种分级标准外，又提出了相应的暂行标准。 外来化合物急性毒性分级（WHO） 毒性分级大鼠一次经口LD50 （mg/kg）6只大鼠吸入4 h，死亡2 4只的浓度（mg/m3）兔经皮LD5

23、0 （mg/kg）对人可能致死的估计量 g/kg g/60kg剧 毒高 毒中等毒低 毒微 毒 11 50 500 5000 1010 100 1000 10000 55 44 350 2180 150.1330250 1000第三节 局部毒性作用（local toxic effect）目的： 了解外源化学物对皮肤、眼睛的局部刺激性和腐蚀性，包括眼刺激、皮肤刺激试验。意义： 试验结果可以为制定防护化学物对眼睛和皮肤保护措施提供依据。 一、眼刺激试验 观察终点：眼刺激和眼腐蚀 眼刺激性（eye irritation）指眼睛前表面接触受试物后产生的眼睛可逆性炎症变化。 眼腐蚀性（eye corros

24、ion）指眼睛前表面接触受试物后产生的眼睛不可逆性组织损伤。 目前眼刺激试验推荐的方法是Draize试验。 使用家兔4只，滴眼后观察结膜（发红、球结膜水肿和分泌物）、角膜（混浊程度和范围）和虹膜（充血、肿胀和角膜周围充血）的反应，按规定的分级标准进行评分。一般观察期为7天，有必要时可延长观察时间到21天。 Draize试验以主观判断为主，故实验室内及实验室间有一定的差异。 兔眼刺激试验Draize test二、皮肤原发性刺激试验（skin primary irritation test） 包括单次和多次皮肤刺激试验，完整皮肤和破损皮肤刺激试验等。 观察终点为皮肤刺激和皮肤腐蚀。 皮肤刺激（de

25、rmal irritation）是指其皮肤接触化学物后产生的局部可逆性的炎症变化。 皮肤腐蚀（dermal corrosion）是指其皮肤接触化学物后产生的局部不可逆性组织损伤。常见的影响皮肤刺激反应的因素： 皮肤的完整性 固态受试物的物理特性 固态受试物的干燥、溶解状态 如受试物可能用于人受损伤的皮肤，则受试动物皮肤也应作相似的处理。 受试物在动物皮肤表面封闭染毒的严密程度实验动物的年龄、性别以及受试部位的影响 年龄增长，皮肤敏感性降低。 一般选用动物背部皮肤（而不是脊柱表面的皮肤） 雌雄性动物皮肤厚度及血液情况有差异。个人主观判断的差别。 种属差异：皮肤反应的敏感顺序为兔豚鼠人猪皮肤刺激试

26、验化妆品安全性评价程序和方法（GB 7919-87）急性皮肤刺激试验（一次皮肤涂抹实验）试验方法： 1. 试验前24 h，将实验动物背部脊柱两侧毛剪掉，不可损伤表皮，去毛范围左、右各约3 cm6 cm。 2. 取受试物0.1 ml（g）滴在2.5 cm2.5 cm大小的四层纱布上敷贴在一侧皮肤上，或直接将受试物涂在皮肤上，然后用一层油纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。另一侧涂赋形剂作为对照。敷用时间一般为24 h，亦可一次敷用4 h。试验结束后用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物。 3. 于除去受试物后的1、24和48 h观察涂抹部位皮肤反应，按表1和表2进行皮肤反应积分和刺激强度评价。红

27、斑形成积分无红斑勉强可见明显红斑中等严重红斑紫色红斑并有焦痂形成01234水肿形成无水肿勉强可见皮肤隆起轮廓清楚水肿隆起约1mm水肿隆起超过1mm，范围扩大01234总分8表1 皮肤刺激反应评分表2 皮肤刺激强度评价强度分值无刺激性轻刺激性中等刺激性强刺激性0 0.40.5 1.92.0 5.96.0 8.0以下情况不适宜做皮肤刺激试验： 根据结构与活性关系及理化特性推测可能有腐蚀性 的物质（如pH 2或pH 11.5）； 在急性经皮毒性试验显示有很强系统毒性的物质； 在急性经皮毒性试验中染毒剂量达2000 mg/kg时仍 未产生皮肤刺激体征的物质。三、皮肤致敏试验（skin sensitiz

28、ation test） 试验方法：福氏完全佐剂（FCA）的方法和不加佐剂的方法。实验动物：常选择豚鼠试验过程： 诱导接触（induction exposure）以较低或中等浓度受试物对皮肤重复染毒（涂皮或皮下注射），一般需14天。 激发接触（challenge exposure）间隔1014天后，用激发剂量（低于诱导时的剂量）受试物处理未染过毒的皮肤部位，然后观察24小时、48小时和72小时后有无皮肤反应，以皮肤反应的严重程度来评分，比较诱导及激发后的水肿、红斑出现的情况，判断受试物是否能产生皮肤超敏反应。四、光变态反应型迟发型超敏反应局部：光接触皮炎全身：全身性光致敏反应 （急性荨麻疹、持续

29、性湿疹、迟发型疱疹）光变态化学物：氨基苯甲酸、氯丙嗪、民丙嗪、对氨基苯磺酰胺、 三叠氮化合物等。五、光刺激反应 因全身或局部接触某些化学物后，经光照引起，通常由紫外线A引起，偶尔也与紫外线B有关。六、局部毒作用的替代试验替代试验研究涉及 眼刺激性/腐蚀性实验 经皮吸收试验 皮肤光毒性试验 皮肤光敏感试验 皮肤刺激性/腐蚀性试验和皮肤变态反应试验目前替代试验的方法 皮肤腐蚀性：大鼠皮肤经皮电阻试验、人重组皮肤模型 EpiSkinTM、EpidermTM和CorrositexTM试验 皮肤变态反应：局部淋巴结检测（LLNA） 皮肤光毒性：3T3中性红摄取光毒试验、猪皮经皮吸收试验、 诱变和光诱变性

30、试验等。第四节 短期、亚慢性和慢性毒性作用一、概述（一）蓄积作用（二）短期、亚慢性和慢性毒性作用的基本概念二、研究方法三、结果评价（一）蓄积作用（accumulation） 蓄积作用：是指外源化学物连续地、反复地进入机体，而且吸收速度或总量超过代谢转化排出的速度或总量时，化学物质就有可能在体内逐渐增加并贮留。 具有蓄积性作用是发生慢性毒作用的前提。蓄积于体内的化学物质可以原型或代谢转化产物的形式，或与机体中某些物质结合的形式存在。 分为： 物质蓄积（material accumulation） 功能蓄积（functional accumulation） 物质蓄积：指当在多次、反复外源化学物对实

31、验动物染毒一定时间后，若能用化学方法测得机体内存在该化学物母体或其代谢产物，如重金属铅、汞、锰和DDT的代谢物等。 功能蓄积：指当在多次、反复外源化学物对实验动物染一定时间后，若能用化学方法测定不出该物质而又有慢性中毒征候，如某些溶剂、有机磷化合物等。 功能蓄积是指多次接触化学物所引起的机体损害累积现象。蓄积毒性的检测方法理化方法：是利用化学分析或同位素技术测定毒物进入机体后，在体内含量变化的过程。生物学方法：是将多次染毒与一次染毒所产生的效应进行比较，生物学方法又分蓄积系数法和残留率测定法。蓄积系数（accumulatin coefficient，K）：是指多次染毒使半数动物出现效应的总剂量

32、（ED50(n)）与一次染毒的半效量（ED50(1)）之比值，即K= ED50(n) / ED50(1)，实验常以死亡为观察的效应，此时LD50(n) / LD50(1)。（二）短期、亚慢性和慢性毒性作用的基本概念 短期重复剂量毒性：14 30 天 28天短期毒性试验，基本成为一种初步估计长期接触可能引起的毒效应的经济实用的短期重复染毒试验。 90天喂养试验 亚慢性毒性（subchronic toxicity）： 较长期（相当于生命周期的1/10） 慢性毒性（chronic toxicity）：长期或终生 新药临床前毒性评价中长期毒性评价与亚慢和慢性概念不同。试验期限取决于临床拟用药的期限，一

33、般为临床用药的2 3倍。如临床用药为3天，长期毒性试验时间定为14天；临床用药为10天，长期试验期限为1个月；未限制的临床用药，才进行6个月的亚慢性毒性试验。重复染毒毒性试验、亚慢性和慢性毒性试验的目的：1. 观察长期接触受试物的毒性效应谱、毒作用特点和毒作用靶器官，了解其毒性机制。2. 观察长期接触受试物毒性作用的可逆性。3. 研究重复接触受试物毒性作用的剂量反应关系，初步了解到确定未观察到有害作用的剂量和观察到有害作用的最小剂量，为确定人类接触的安全限量提供参考值。4. 确定不同动物对受试物的毒效应的差异，为将研究结果外推人提供依据。二、研究方法（一）试验设计实验动物的选择染毒方式与染毒期

34、限剂量的选择和分组观察指标（二）长期毒性试验的注意事项 实验动物的选择 1）物种、品系：两种动物啮齿类和非啮齿类 大鼠（Wistar和Sprague-Dawley）和犬（Beagle犬）；兔或豚鼠 2）性别、年龄和动物数 性别：雌雄各半，特殊情况下选择单性别的动物如研究某种受试物对 性腺毒性或生殖毒性。 年龄：刚离乳不久的动物，大鼠6 8周龄（体重80 100 g）， 小鼠15 g，同组平均体重 10%，组间 5%。 数量：大鼠、小鼠每组不小于20只；犬、猴每组不少于6只3）微生物学寄生虫学等级和饲养条件 尽可能采用高等级动物（清洁级及以上等级的动物）。 环境：在屏障环境下，人员、物品、空气、

35、温度、湿度、噪声、空气 清洁度、笼具、饲料等。染毒方式 原则：尽量选择和人类接触途径相似；与预期进行的慢性 毒性研究的接触途径一致。 频率：一次/日 连续给药。 需注意的问题：1）经口建议用灌胃法，量准。2）呼吸道染毒，通常每日2 6 h，间歇性吸入适用于工业毒物， 每天吸入6 8 h，连续性吸入适用于环境接触，一般要求吸入 22 24 h。3）犬静脉注射，大鼠腹腔注射替代，注意无菌操作。4）特殊途径，如直肠等量不能保证，较难进行。5）每日染毒时间保持一致。剂量选择和分组 至少设立三个染毒组和一个阴性（溶剂）对照组原则： 高剂量 引起明显毒性或少量动物死亡（少于10%） 中剂量 理想为观察到有害作用的最低剂量 低剂量 无中毒反应组距以3 10倍为宜，一般不少于2倍亚慢性和慢性试验的剂量设计： 以相同物种的短期毒性资料为依据。 亚慢性试验可依据急性毒性的阈剂量为最高剂量，或1/51/20的LD5