丹参新酮抗血小板作用及对血栓形成的影响

1、丹参新酮抗血小板作用及对血栓形成的影响第一章丹参新酮对血小板功能的影响目的: 血栓性疾病严重威胁人类健康,需要更多供选择的抗栓药物治疗。 血小板的过度活化是血栓形成的一个重要因素,因而抗血小板药物是其中重要一类。目前市售抗血小板药物存在诸多不足, 从传统中药寻找抗血小板活性成分是一个良好途径。前期实验我们从丹参中发现一个抗血小板活性成分, 但其作用特点及机制尚不清楚。本部分实验主要研究丹参新酮对血小板功能的影响及其可能的作用机制。方法 : 取健康成年雄性小鼠外周血 , 制备洗涤血小板和富血小板血浆 (PRP)。用血小板聚集仪评价丹参新酮对不同激动剂 ( 胶原、 CRP、凝血酶、 ADP、花生四

2、烯酸 ) 引起的血小板聚集的影响; 用血小板聚集仪评价丹参新酮对胶原、凝血酶引起的血小板释放的影响; 用流式细胞仪评价丹参新酮对胶原、凝血酶诱导血小板 p-selectin和 JON/A的表达 ; 采用显微荧光技术检测丹参新酮对血小板在胶原表面的黏附和纤维蛋白原上扩展功能的影响; 观察丹参新酮对血小板经凝血酶诱导的斑块回缩功能的影响; 用流式细胞仪评价丹参新酮对不同激动剂诱导的血小板 ROS的影响和血小板胞内Ca2+的影响 ; 采用免疫蛋白印迹法检测丹参新酮对血小板相关信号通路的影响。 结果 : 终浓度为 2 M,4M,8M的丹参新酮浓度依赖性地抑制胶原、 CRP、凝血酶引起的血小板聚集, 对

3、 ADP(4M,10M)和花生四烯酸 (100 M,50M)引起的血小板聚集无影响。丹参新酮能够抑制胶原与凝血酶引起的血小板ATP释放 ; 抑制胶原诱导的血小板 p-selectin和 JON/A的表达。丹参新酮可抑制血小板在胶原表面的黏附和在固化纤维蛋白原表面的扩展。丹参新酮能够显著抑制血小板斑块回缩但不影响血小板胞内钙离子的释放。免疫印迹实验结果显示 , 丹参新酮能够抑制胶原受体下游的PLC2,PKC,Akt,GSK3,ERK1/2 等蛋白的磷酸化。丹参新酮能够降低由整合素IIb 3 介导的“ outside-in”信号中的 Src和 FAK磷酸化水平 , 但是不抑制 3 磷酸化。丹参新酮

4、可抑制 CRP诱导引起的血小板胞内 ROS水平增加 , 但对凝血酶诱导的胞内 Ca2+的内钙释放和外钙内流均无明显影响。结论 : 丹参新酮可能通过影响血小板 PLC2/PKC/ERK1/2,PI3K/Akt,Src/FAK信号抑制血小板“ inside-out”和“outside-in”信号通路 , 从而抑制血小板活化和聚集, 最终发挥抗血小板效应。 第二章丹参新酮对血栓形成的影响目的 : 上一章实验研究发现丹参新酮具有较好的体外抗血小板活性 , 且起效浓度较低。但是丹参新酮是否在经机体代谢后仍具有抗血小板活性甚至抗栓活性尚不清楚。因此 , 我们在体研究丹参新酮的抗血小板作用, 同时观察丹参新

5、酮对实验动物血栓形成的影响。方法 : 在体给药检测丹参新酮对胶原和凝血酶诱导的血小板聚集的影响。建立小鼠胶原合并肾上腺素制备小鼠肺栓塞模型, 尾静脉注射丹参新酮后 , 观察其对模型小鼠肺血栓形成的影响; 建立三氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓模型, 观察尾静脉给予丹参新酮后 , 小鼠颈动脉血栓形成时间的变化; 下腔静脉狭窄法建立小鼠深静脉血栓模型 , 观察尾静脉给予丹参新酮后, 丹参新酮对小鼠下腔静脉血栓形成率、血栓大小、血栓长度的影响。观察丹参新酮对小鼠断尾出血时间的影响。结果 : 尾静脉给予丹参新酮0.5 h后 , 胶原和凝血酶诱导的血小板聚集相比对照组显著减弱。丹参新酮改善肺栓塞小鼠的自发症状

6、, 减少胶原联合肾上腺素引起的小鼠肺部微血栓的形成。丹参新酮能延长小鼠颈动脉血栓的形成时间, 丹参新酮能够降低深静脉血栓发生率 , 并抑制深静脉血栓模型小鼠血栓长度。丹参新酮能够轻微延长小鼠断尾出血时间。结论: 丹参新酮可抑制小鼠血栓形成 , 轻度延长出血时间。第三章血小板微颗粒 (PMPs)对深静脉血栓形成的影响目的: 静脉血栓的产生机制与动脉血栓存在显著差异, 血小板在上述两种血栓形成过程中可能发挥了不同作用 , 具有促凝作用的 PMPs可能介导深静脉血栓的发生, 从而在静脉血栓发生过程中发挥重要作用。为进一步探讨丹参新酮对深静脉血栓形成的影响, 我们以PMPs为切入点 , 通过研究 PMPs对深静脉血栓形成的影响, 研究血小板与深静脉血栓形成的可能联系。方法 : 用流式细胞术建立 PMPs测定方法 ; 比浊法研究 PMPs对血小板聚集的影响 ; 流式细胞术检测下腔静脉狭窄小鼠外周血PMPs的相对含量 ; 流式细胞术研究PMPs对小鼠外周血中性粒细胞活化的影响; 免疫荧光实验研究PMPs对小鼠深静脉血栓中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的影响。结果 :PMPs自身不引起血小板的聚集 , 但能够促进胶原诱导的血小板聚集 ;PMPs能够促进下腔静脉狭窄所致深静脉血栓形成。DVT小鼠外周血中 PMPs