复旦大学生物化学分子生物学部分课件-蛋白质代谢

1、蛋白质的生物合成-翻译Protein Biosynthesis-Translation特点 -翻译过程十分复杂 -参与因素多 -合成步骤繁 20种氨基酸 mRNA和遗传密码 tRNA 核糖体 酶和辅助因子及无机离子、以ATP 、GTP 合成方向：NC端UTRUTRPart IDecoding of the Genetic codeProteins are synthesized at rough ER核糖体 20世纪50年代Paul Zamecnik通过将同位素标记的氨基酸注射到大鼠体内，按不同时间取肝脏分析同位素标记的氨基酸跑到哪里去了。时间长了会在任何地方都有同位素标记，但在注射后数分钟就

2、检测，同位素全部跑到了含有RNA的小颗粒中（即核糖体， ribosome)。 遗传密码的概念：mRNA 上的核苷酸顺序与蛋白质中的氨基酸之间的对应关系称为遗传密码。mRNA上每三个连续核苷酸对应一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子，或三联体密码（triplet codons）。 三个不同的实验证明了遗传密码是mRNA上3个连续的核苷酸残基构成的，下面给出了三个证明遗传密码是三联体密码的著名实验的示意图。 Nirenberg、Khorana因遗传密码的破译而与另一位科学家（霍利）分享了1968年诺贝尔生理学奖。遗传密码1957年Hoagland, M.B.发现，将氨基酸、ATP和肝细胞质放在

3、一起，氨基酸会与热稳定的一类小分子RNA结合在一起，后来被证明这就是tRNA分子。同年, F. Crick 在比较了核酸和氨基酸的大小和形状后，认为不可能在空间上互补，因此他对核酸蛋白质的信息传递作了以下预测：1). 它是一种分子转换器，使信息从核酸序列转换成氨基酸序列；2). 这种分子很可能是核酸；3). 它不论以何种方式进入蛋白质翻译系统的模板，都必须与模板形成氢键（即配对）；4). 有20种分子转换器，每种氨基酸一个；5). 每种氨基酸必定还有一个对应的酶，催化与特定的分子转换器结合。根据抽屉原则，Crick还预言一个氨基酸对应三 个核苷酸。Crick预言的分子转换器(adaptor)D

4、NA recombination experiments that proved the genetic codons as tripletsMutation experiment tells: Triplets do not overlap, but there are three reading framesPre-requirement for elucidation of the Genetic code要有确定的已知序列的mRNA要有同位素标记的氨基酸1955年，Marianne Grunberg-Manago 和 Severo Ochoa从细菌中发现了一个酶，polynucleot

5、ide phosphorylase (PP), 催化以下反应： (NMP)n + NDP (NMP)n+1 + Pi 这是第一个发现的核酸聚合酶，为模板非依赖性，在细菌中主要起降解RNA的作用, 但可用来随机合成RNA多聚物。第一个被确定的密码子是TTT，对应Phe. 1961年，Marshall Nirenberg用PP合成了poly(U), 将它放入20根试管中，每根试管中加入了大肠杆菌细胞质抽提物和一种有同位素标记的氨基酸。反应一段时间后用TCA（三氯乙酸）将蛋白质沉淀下来，测定同位素的量，结果发现在加了同位素标记Phe的试管的沉淀物中同位素含量特别高。很快，密码子CCC对应Pro, A

6、AA对应Lys, 但poly(G)没有得到结果（高级结构的缘故）。用统计法尝试确定含多种核苷酸的密码子的碱基组份1964年Nirenberg等发现将核苷酸三联体与对应的AA-tRNA放在一起，AA-tRNA就会结合到核糖体上去。核糖体结合实验:The final solution几乎同时，Gobind Khorana成功地合成了非随机重复的多聚核苷酸。当这些多聚物得到的结果与 Nirenberg的结果进行比较时，得到了确切的密码子信息。如 (AC)n得到的结果是H和T等量参入，而密码的分布是等量的CAC和ACA,因此CAC对应H, ACA对应T. 1965年由Crick绘制的密码表，UGA,

7、UAA和UAG因为没有对应的氨基酸而导致肽链合成终止，因此定义为终止密码子(stop codon), 而从蛋白质的N末端测定的数据表明Met对应的是起始密码子。The genetic codeThe present genetic code is universal in all organisms on the earth唯独在线粒体、支原体等中有少量变化酿酒酵母光滑球酵母彭贝裂殖酵母丝状真菌锥虫莱茵衣藻 密码子的简并(degeneracy)是预料之中的事。事实上所对应的密码子的多少与该氨基酸在生物中的利用度成比例。 并不是一个tRNA对应一个密码子，一般只有三十几种tRNA来对应61个密码

8、子，因此需有个机制让tRNA“偷懒”。这就是Crick的Wobble假说 .密码的特点连续性兼并性在不同生物中使用同义密码子的频率是不相同的偏爱密码摆动配对（变偶现象）通用性线粒体的密码有一定的差别AUG起始密码和甲硫氨酸UAG、UAA、UGA终止密码硒半胱氨酸是大肠杆菌的第21个拥有密码子的氨基酸（识别UGA）高浓度时取代正常Cys，用在同步辐射实验中从蛋白质化学的角度看,遗传密码已经得到优化影响小影响大氨基酸的突变从其疏水指数的变化对蛋白质的构象的影响来看密码子的进化程度。J. Mol. Evol (2003) 57: 533537.现有密码子的计算值氨基酸的亲疏水性指数（hydropat

9、hic index）可以用来指示肽链局部的亲疏水程度，以预测它在蛋白质的内部还是外部RNA editing 后读框的变化翻译到一半出现的“换马”现象Frame-shift in protein synthesis of Rous sarcoma virus“基因中的基因” 三个读框同时被利用的例子大肠杆菌174 的基因组Protein Biosynthesis 真核细胞中，蛋白质的合成需要： 70种以上的核糖体蛋白参与； 多于二十种的酶来激活氨基酸； 12种或更多的辅酶和其它专一性的蛋白因子来进行肽链合成的起始、延伸、和终止；一百多种酶参与各类蛋白的最后修饰；还需要多于四十种的tRNA和核糖体

10、RNA。共有300多种不同的生物大分子参与且协同地 工作来合成多肽。核糖体(Ribosome)是蛋白质合成的场所 核糖体是由几十种蛋白质和几种rRNA组成的亚细胞颗粒，其中蛋白质与rRNA的重量比约为1:2。核糖体是蛋白质合成的场所。原核生物核糖体的组成mRNAtRNA大肠杆菌核糖体的结构（15A）原核与真核生物的核糖体比较大肠杆菌的55个蛋白质和3条rRNA可以在试管中自发折叠成有天然活性的核糖体大肠杆菌中30S的亚基能单独与mRNA结合形成30S核糖体-mRNA复合体，后者与tRNA可以专一性结合。50S亚基不能单独与 mRNA结合，但可以非专一地与tRNA结合， 50S亚基上有两个tRN

11、A结合位点：氨酰基位点-A、肽酰基位点-P。还有一个GTP结合位点。核糖体上的功能部位核糖体的A部位与P部位： P位和A位，二者紧密连接，各占一个密码子的距离。 P：结合起始的氨酰-tRNA和肽酰-tRNA， A：结合新掺入的氨酰- tRNA。 P位上肽酰- tRNA上的羧基与进入A位的氨酰- tRNA上的氨基形成新的肽键P位上tRNA卸下肽链成为无负载的tRNA核糖体移动一个密码子的距离，A位上的肽酰- tRNA又回到P位，A位又空，再进行下一次循环。第一步 氨基酸的活化 Activation of Amino Acids第二步 起始 Initiation第三步 延伸 Elongation第

12、四步 终止与释放 Termination & Release第五部 折叠和修饰 Folding and Posttranslational Processing tRNA的结构特征氨基酸的活化氨基酸的活化由氨酰-tRNA合成酶催化：特异性强，催化特定的氨基酸与特异的tRNA结合，每种氨基酸有特异的合成酶催化，此种特异性保证了遗传信息准确翻译。氨基酸 + ATP + tRNA氨基酰 氨（基）酰-tRNA + AMP + ppi氨基酰tRNA的表示方法丙氨基酰tRNA：Ala-tRNAala精氨基酰tRNA：Arg-tRNAarg甲硫氨基酰tRNA： Met-tRNAmet起始密码子AUG编码的M

13、et由tRNAimet （真核） 或tRNAfmet（原核）转运。真核细胞起始密码子编码的Met不须甲酰化大肠杆菌起始密码子编码的Met须甲酰化氨酰-tRNA的合成(Aminoacyl-tRNA) 氨酰-tRNA的结构 细胞中一般只有二十种氨酰-tRNA合成酶，不同tRNA与同一氨基酸的结合均由同一个酶催化。合成酶有很强的校对功能。酵母蛋白中只有3000分之一的概率Val会被错误地合成到本来应该是Ile的位置中去。核糖体上只对密码子反密码子进行校对，不对AA-tRNA校对氨酰-tRNA合成酶双筛机制确保正确但Ile-tRNA合成酶对Val和Ile的选择性上只有200的差异，剩下的一个数量级的差

14、异在于第二个活性位点的校正功能。tRNA上氨酰-tRNA合成酶进行识别的碱基黄色碱基为识别所需Ala-tRNA的识别特别简单，只有一对GU碱基I型合成酶多数为单体结构II型合成酶多数为二聚体结构翻译起始（原核） mRNA +30S亚基-IF330S亚基 mRNA IF3- IF1复合物30S mRNA GTP- fMet tRNA- IF2- IF1复合物70S起始复合物mRNA与30S形成复合物,IF1、IF3参与复合物的形成.mRNA中的SD序列与30S的互补序列结合.IF1fmet-tRNA的结合：与以上过程同时发生，fmet-tRNA辨认并与mRNA 模板中的AUG结合。反应需IF2,

15、GTP,Mg2+参与;而IF3脱落.50S的结合：50S与30S复合物形成70S启动前复合体,同时伴有GTP水解；IF1 IF2脱落,形成了启动复合体.IF2-GTP-fMet-tRNAIF350S亚基IF2+ IF1+GDP+Pi70S启始复合物由大、小亚基,mRNA,fmet-tRNAfmet构成核蛋白体上含给位p与受位A，AUG信号与给位相对应结合。同时fmet-tRNA的反密码子CAU与mRNA的AUG互补结合.Howard Dintzis 1961年证明蛋白质的合成方向从N端往C端标记后分离完整的蛋白质分子进行肽谱分析原核与真核的翻译起始复合物有较大的差别原核翻译起始复合物依赖于16

16、SrRNA与mRNA的相互作用Characteristics of mammalian translation factorsNameFunctioneIF1AeIF2eIF2aeIF2BeIF3Promotes Met-tRNA binding, ribosomal dissociationBinds Met-tRNA and GTPSite of phosphorylation on Ser-51Guanine nucleotide exchange factor for eIF2Dissociates ribosomes, promotes Met-tRNA and mRNA bindi

17、ngeIF4AATPase, helicase, binds RNAeIF4BBinds RNA, promotes helicase activityeIF4ECap-binding subunit, part of eIF4F complexeIF4GBinds eIF4A, eIF4E and eIF3 acts as bridging factoreIF5Promotes GTPase with eIF2 and ejection of eIFseIF6Binds to 60S ribosomes, promotes dissociationEukaryotic initiation

18、of translationPrecise sequence of eventsEukaryotic translation initiation can occur at IRES一些基因5端具有一段较短的RNA序列（约150-250BP），这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译，这段非翻译RNA被称为内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site, IRES）。 IRES能招募核糖体对mRNA进行翻译。将IRES与外源cDNA融合，发现IRES能独立地起始翻译。 肽链的延长延长即核蛋白体自mRNA 5端向

19、3端推进，反应需延长因子（elongation facters-EF）EFTu、GTP和无机离子参与。狭义的核蛋白体循环进位转位成肽AA2原核生物多肽合成延伸过程示意图注意使用GTP而非ATP，是因为GTP会导致蛋白质构象的变化,容易从核糖体上脱落肽键形成机制聚核糖体(polysome)可以加快蛋白质合成原核生物中转录与翻译偶连在一起原核和真核mRNA结构的比较核糖体可以不从mRNA上解离连续合成三个蛋白质第一个肽键的形成需要4个高能键（包括AA-tRNA的校正所需的能量），约122kJ/mol。但所花费的高能代价可以确保正确的两个相邻氨基酸之间形成肽键。其中EF-Tu所使用的GTP对核糖体的

20、校正功能起重要作用，因为EF-Tu-GTP和EF-Tu-GDP复合物均存在数毫秒的时间，为密码子和反密码子的相互作用的校正提供了时间。下图的GTPS由于裂解的时间更长而能进一步提高正确性，但会牺牲合成速度。肽链合成终止需终止因子RF、RR和IF3参与。终止信号出现，释放因子（release factor, RF, RR）与其结合。RF有三种RF1、RF2、RF3。大肠杆菌中有三种释放因子RF1，RF2和RF3。RF1识别A位的UAG和UAA，而RF2识别A位的UGA和UAA，它们均有从tRNA上切离肽链并将tRNA从P位赶走的功能。RF3的功能不明，一般认为是它将30S和50S分开。 真核生物

21、中只有一种RF，称为eRF, 承包所有的工作。嘌呤霉素导致肽链提前从核糖体脱落由链霉菌产生，结构与氨酰-tRNA的3端非常像，与核糖体的A位结合参与肽键形成，形成肽酰嘌呤霉素。由于嘌呤霉素不能进行转位，从核糖体上解离下来，导致肽链合成提前终止。Post-translational ModificationsN端和C端修饰 (原核:N-formyl基团的去除; 真核约50%在N端发生乙酰化)；信号肽切除；磷酸化(Ser,Thr,Tyr)、-羧基化(Glu)、甲基化(Lys,Glu);糖基化；异戊二烯基化(isoprenyl)；辅基的添加；蛋白酶水解；二硫键的形成； 磷酸化可提供阴离子而大量出现在

22、酪蛋白上，因此它可以结合大量的钙离子。Ser，Thr的磷酸化常出现在酶活性的调控上。而Tyr的磷酸化则是信号转导中最重要的手段。凝血过程中的几个重要因子（VIII因子和IX因子等），均需要接受羧基化修饰才能拥有蛋白水解酶的活性，这种修饰是Vitamine K依赖性的。 肌肉中的一些蛋白质和Cyto- chrome C 的Lys会受到单甲基和二甲基化修饰；钙调蛋白会受到三甲基化修饰；所有C末端以Glu结束的蛋白质其Glu会受到甲基化修饰。 Ras是一个锚定在膜内侧的癌基因产物，其锚定机制依靠在其C末端添加的法呢基（两个异戊二烯构成）。 Cleavage of signal peptide is

23、essential for protein secretionProcessing of proinsulin胰岛素在接受加工后方有生理活性。Protein disulfide isomerase (PDI) Inhibition of Protein Synthesis 原核 嘌呤霉素(Puromycin)：使肽链“早产”。 四环素(Tetracyclines)：占取A位，抑制氨酰tRNA的结合。 氯霉素(Chloramphenicol)：抑制肽链转移（包括线粒体和叶绿体）。 链霉素(Streptomycin)：引起密码易位错读。 真核 环己酰亚胺(Cycloheximide)：抑制肽链转移

24、。 白喉毒素(Diphtheria toxin): eEF2的ADP修饰。 蓖麻毒素(Ricin): 23SrRNA上发生脱嘌啉。环己酰亚胺，也称放线（菌）酮Action of diphtheria toxin(白喉毒素)白喉酰胺Phosphorylation of eIF2 stops protein synthesis of in eukaryotic cellsViral inhibition of cellular translationSome viruses (adenovirus and influenza virus) cause dephosphorylation of eI

25、F4E Others e.g. picornavirus cleave eIF4G into 2 fragmentsC-terminal fragment still interacts with eIF3 and eIF4A N-terminal fragment still interacts with eIF4EMechanism of shutting down host cell translation while maintaining their own小RNA病毒 真核 原核 核蛋白体 80S 70S 含蛋白数量 多于80 少于60 小亚基结构 无嘧啶区和互补区 含嘧啶区与互补 tRNA tRNAimet tRNAfmet 启动 eIF 9-10种 需ATP 小亚基先与tRNA结合，在与mRNA结合延长 EF1、EF2 EFTu、EFTs 终止 RF 需 GTP RF1、RF2、RF3 真核与原核蛋白质合成的异同蛋白质的定向移动和降解Targeting & Degradation分泌到内质网(ER)糖基化定向到线粒体和叶绿体定向到细胞核从外界摄入蛋白质蛋白质的降解Signal recognition particleThe destiny of pro