内蒙古大学基因工程实验指导

1、基因工程实验指导基因工程实验课程的内容是从亚克隆一个基因直到最终表达出该基因产物的一个完整的科研项目。以表达纳豆激酶为例，从已经克隆在pMD-18-T载体上的纳豆激酶酶原基因上用PCR扩增出837bp的纳豆激酶成熟肽基因片段，与T载体连接后转入DH5a菌中筛选鉴定，然后用双酶切下纳豆激酶成熟肽基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-Trx，在表达菌BL(21)DE3中诱导表达出纳豆激酶蛋白质并用SDS鉴定。整套实验围绕纳豆激酶基因的亚克隆、重组、转化、筛选直到表达这一研究顺序进行操作。其间共涉及学习约11种基因操作的基本技术，我们按这些操作技术出现的先后顺序分别编为实验一至实验十

2、一。各个实验之间具有很强的逻辑性和连贯性，前一个实验的结果就是下一个实验的原料。整套实验设计实际上是一个基因操作实验平台，随时能根据需要更改外源基因和表达载体或进一步扩充实验内容。我们在每年的教学实践中会不断增加目的基因和表达载体的种类，以便于学生实验小组能够从事不同的项目，减少雷同，增加兴趣。基因工程实验的宗旨是让学生在独立实践操作中学习基因工程的基本研究方法和体会基因工程研究的严密逻辑和科研理念。实验教学的组织方式是科研项目式管理，即在教师的总体指导下，在给定的实验材料和实验条件的基础上，让学生独立思考、自行规划实验流程、制定实验计划、准备实验材料、动手操作、整理和分析实验结果，最后完成实

3、验项目，写出实验论文。因此学生在实验前要认真预习实验内容，结合学过的基因工程原理，弄懂每一步实验的目的和原理，了解实验的内容和总体实验方案，写出基因工程大实验开题报告，交教师审阅和讨论修改后才能进入实验室操作。在实验过程中，教师不干涉学生的实验安排和操作程序，仅以导师的身份对学生的实验操作进行现场巡回指导、回答学生的疑问、为学生示范一些高档实验仪器和软件的使用，提供公用的试剂（如酶）等，并对学生的每一步实验结果进行评价和把关。因局部实验失败而没有取得预期的结果，无法进入下一步实验的小组，先要与教师讨论分析失败的原因，然后向其他成功组的同学或教师索取实验材料继续进行。基因工程实验注意事项1.上实

4、验课的学生每两人分为一个小组，登记领取微量移液器（1000mL, 200mL和10mL各一支）。2.课前要提前预习实验内容，弄懂实验设计的目的，理清实验顺序。认真填写本科基因工程实验论文开题报告，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。3.实验指导中所写的实验一、实验二等并非严格的实验顺序，只是提供一种相关的实验操作技术。各小组学生应根据整体实验方案制定自己的实验顺序和计划。4.实验指导中所写的实验操作技术和步骤仅供参考，学生在弄懂操作原理和目的的基础上多动脑筋，摸索适合自己的操作技巧。5.由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排，分别记录实验操作

5、和结果。6.实验指导中的所有单项实验都属于一个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，全部实验必须在10天之内完成。7.每一步实验都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！8.对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是PCR仪、微量移液器！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。9.写作开题报告、实验记录和实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻（包括操作错误和结果失败）。10.在实验室内不能大声喧哗。11.在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！特别注意对

6、废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放和处理。12.实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。13.值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。14.实验时损坏的任何物品都要及时申报，并按照生命科学学院实验中心的有关规定进行适当的赔偿。15.实验需要的油性记号笔、计时器（或手表）、卫生纸、白大衣、擦手毛巾等需要自备。实验一质粒DNA的小量制备【实验目的】学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。【实验原理】根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，DNA双螺旋结构被解开而变性。尽

7、管在这样的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去，质粒DNA和小分子RNA留在上清液里，用乙醇沉淀即可得到质粒DNA。【实验用品】1.器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，恒温摇床，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机，pH计，制冰机。摇菌试管洗净并盖上盖、

8、1.5mL离心管装入不锈钢饭盒、吸头（10mL，200mL，1000mL）装入相应的吸头盒，一起高压（121C 20min）灭菌。2.试剂（1）LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water搅拌完全溶解，用约200mL 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121C 20min灭菌。使用时加入氨苄青霉素，终浓度100mg/mL。（2）氨苄青霉素储存液：无菌水配制100mg/mL，分装后-20C保存。（3）溶液 I 葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，1

9、0mmol/L EDTA ，调pH8.0（4）溶液 II（NaOH/SDS溶液)：0.2mol/L NaOH，1% SDS，现用现配（5）溶液 III KAc溶液（pH4.8）：60mL 5mol/L KAc，加冰乙酸调至pH4.8，补dd water至100mL（6）10mg /mL RNase A：RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中（7）TE 缓冲液：10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0，高温高压灭菌（8）95%和70%乙醇（9）0.5mol/L EDTA pH8.0：称取18.61g

10、Na2EDTA2H2O，加入约80mL的去离子水，充分搅拌。用NaOH颗粒调节PH值至8.0（约2g NaOH）使其完全溶解。加去离子水将溶液定容至100mL。高温高压灭菌。（10）1mol/L Tris HCl pH7.5：称取12.1gTris碱,加80mL蒸馏水，缓慢地加浓盐酸至pH6.8（约加6.5mL）。让溶液冷却至室温，调至pH7.5，加蒸馏水至100mL。高温高压灭菌后4C保存（11）1mol/L Tris HCl pH8.0：称取12.1gTris碱,加80mL蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.0（约加4.2mL）。让溶液冷却至室温，调至pH8.0，加蒸馏水至100mL。高温高压

11、灭菌后4C保存3.材料带有pET-Trx质粒载体的DH5a菌,带有pMD18-T-NK（纳豆激酶）载体的DH5a菌，保存在-80C。【实验方法】1.在超净工作台中分别吸取5mL和2 mL LB（Amp+），分别加入两支灭菌的摇菌管中。2.从超低温冰箱中取出保存pET-Trx载体的菌种和pMD-18T-NK的菌种，在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/mL氨苄青霉素）中搅拌一下，操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！37C摇床中摇过夜。pET-Trx菌：接种于5mL LB（Amp+）pMD18-T-NK菌：接种于2mL LB（Amp+）3.取

12、1.5mL的菌液于1.5mL离心管中，10000r/min离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。pET-Trx菌：3管（31.5mL）pMD18-T-NK菌：1管（1.5mL）4.在沉淀中加入100mL溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置15min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的碎冰块备用。）5.加入200mL溶液II，盖上盖后上下轻微颠倒几次混匀，插入冰中，放置15min。6.加入150mL溶液III，盖上盖后上下轻微颠倒几次混匀，插入冰中，放置15min。7.14000r/min离心510min，小心吸取400mL上清液于另一个干净的1.5mL离心管中，（

13、不要将白色沉淀物带入！如带入可重新离心），加入800mL 95%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下（或冰上）静置510min。8.14000r/min离心10 min，小心弃掉上清液，加入500mL 70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。14000r/min离心10 min，小心弃掉上清液，在卫生纸上倒置轻磕，尽量弃干净。9.再加入500mL70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。14000r/min离心10 min，小心弃掉上清液，在卫生纸亦上倒置轻磕，尽量弃干净。10.离心管倒置在37C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。11.pMD

14、18-T-NK加入30mL无菌蒸馏水或TE缓冲液；3管pET-Trx质粒中每管加入10mL蒸馏水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下（约2000r/min 1min），使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在pET-Trx质粒中加入1mL RNaes A。用油性记号笔标记后放入4C冰箱中备用。12.在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，撰写实验记录。13.有条件的话，可以选作用分光光度计测定质粒DNA的浓度：用dd water稀释20倍，并以dd water为对照，在波长260nm，280nm及310nm处读O

15、D值。通过下列公式计算DNA的浓度（mg/mL）：ssDNA浓度=33（OD260OD310）稀释倍数dsDNA浓度=50（OD260OD310）稀释倍数ssRNA浓度=40（OD260OD310）稀释倍数【思考题】1.影响最终质粒产量的主要因素有哪些？2.提取到的质粒纯度将直接影响到以后的酶切效果，如何操作才能尽可能地避免蛋白质的污染？实验二质粒DNA电泳鉴定【实验目的】学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳技术。【实验原理】DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度和形态的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。【实验用品】1.器材电泳仪

16、，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块。250mL三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，微量移液取样器，1.5mL离心管，双面微量离心管架，试管架，一次性薄膜手套等。2.试剂（1）50TAE电泳缓冲液（pH约8.5）：Tris碱 242g，57.1mL冰乙酸，37.2g Na2EDTA2H2O，dd water 定容至1L。使用时稀释成1。（2）1000溴化乙锭储存液（0.5mg/mL）：50mg溴化乙锭溶于100mL dd water，4C避光储存。使用时在蒸馏水里滴入适量，使水看起来微微发红即可。（3）10加样缓冲液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDT

17、A pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝（4）6加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液（5）DNA分子量标准：lDNAHindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等。（6）电泳级琼脂糖粉3.材料pET-Trx质粒，pMD18-T-NK质粒，PCR产物或DNA酶切产物等。【实验方法】1.称取0.25g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入25mL 1TAE电泳缓冲液（注意原液是50，需要自己稀释！），用保鲜膜盖住，放入微波炉中烧开（0.5min）。25mL 正好能倒满一块小胶。实验时可以根据需要少倒一些，以制作较薄的胶。如果电泳样品少的话，可与其他组共用一块

18、胶，或在电泳结束后将带有DNA的胶切下来放入EB染色，剩下的胶块用保鲜膜包住放到4C冰箱，以便下次再用。2.注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。3.戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却至不烫手（约5060C）。4.把梳子（最细的齿）插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相差12mm即可，但尽量不要太厚，更不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置1020分钟待胶完全凝固。（如有剩下的胶溶液，封口后留待以后再熔化使用）。5.在水平电泳槽中加满1TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至10V/cm（170

19、V），注意正负电极的位置连接正确。6.待胶完全凝固后（1520分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极（黑色电极）。7.取1小片光面纸，点6mL蒸馏水、1mL10加样缓冲液，再加入3mL质粒DNA溶液制成10mLDNA混合样品。在做PCR产物或酶切产物电泳的时候要根据DNA的量上样。8.在凝胶上选择相邻的加样孔。用10mL的吸液头分别将纸上的混合样品加入凝胶的加样孔中。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手指夹住移液器下部，以减少移液器的抖动。看到带有蓝色样品的吸管尖头伸进加样孔后（

20、不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中，切不可使蓝色样品流到孔外。在电泳PCR产物或酶切产物时，在相邻的加样孔中加入2mLDNA分子量标准物。9.打开电源开关，170V电泳。样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30min。10.当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。将没有使用的凝胶部分切下来收入溶胶瓶，回收再用。11.把带有样品的凝胶小心放入盛有EB的搪瓷盒中。以下需戴手套到专门的染色区操作。放置约10分钟后，取出来在自来水中浸泡10min。用自来水冲洗后放入凝胶成像系统中拍照。照片要

21、以合适的文件名保存，以便写论文的时候调用。12.染有EB的凝胶和手套（只要手套没破，可以节约使用：将手套脱下来以后张开口放在染色区，下一次把手伸进去即可）要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。不可用接触过EB的手套接触电脑或凝胶成像仪的门。13.撰写实验记录。【思考题】1.泳道中的质粒DNA有几条带？为什么？2.溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA?3.影响本实验结果的因素有哪些？实验三质粒DNA的酶切【实验目的】学会用限制性内切酶切割DNA。【实验原理】II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电泳把酶切后的DNA片段混合物

22、分离。可根据DNA上已知的酶切位点和预期的酶切结果，与DNA分子量Marker对比，判断酶切是否成功。【实验用品】1.器材旋涡混合器，微量移液取样器，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴锅。移液器吸头、0.5mL和1.5mL微量离心管分别高压灭活。2.试剂（1）50TAE电泳缓冲液（pH约8.5）：Tris碱 242g，57.1mL冰乙酸，37.2g Na2EDTA2H2O，dd water 定容至1L。使用时稀释成1。（2）1000溴化乙锭储存液（0.5mg/mL）：50mg溴化乙锭溶于100mL dd water，4C避光储存。使用时在蒸馏水里滴入适量，使水看起来微微发红即可。（3）10加样缓

23、冲液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝（4）6加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液（5）DNA分子量标准：lDNAHindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等。（6）电泳级琼脂糖粉（7）EcoR I和BamH I内切酶，10内切酶缓冲液3.材料pET-Trx质粒【实验方法】1.先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。混合下列溶液于一个高压过的0.5mL微量离心管中：自提的pET-Trx质粒DNA 8 L10酶切缓冲液（用BamHI的缓冲液） 4 Ldd water 26 LEco

24、RI 1LBamHI 1L总体积 40L2.加完质粒、缓冲液和水后，从-30C冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。3.用一只手的手指捏住盛放酶的微量离心管的上部（以免手指给酶液加温），另一只手持10L微量移液器，让吸头尖部刚好伸进酶液即可，吸取1 LEcoRI限制性内切酶。更换吸头后吸取1 LBamHI限制性内酶。吸完酶后立即把内切酶液送回冰柜！4.在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后，轻轻震动微量离心管，使管中的溶液混匀。再在离心机中2000r/min离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在37C水浴中酶切3-4 h。注意不同的内切酶的最适酶切温度不同。5.取少量（约10L）酶切产物，与合适

25、的已知分子量的DNA（如先前的PCR产物或Marker等）对比电泳（方法见实验二），以确认酶切是否成功。根据已知的酶切位点，判断酶切结果。6.酶切后的目的片断可以回收备用（方法见实验五）。7.清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验记录。【思考题】1.酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？2.如何估计DNA用量和酶的用量？3.在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？实验四PCR扩增制备目的基因【实验目的】学会PCR仪的设置和PCR操作的基本技术。【实验原理】将待扩增的DNA模板加热至94变性，再降低温度与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性复

26、性延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。复性温度可根据引物设计软件Oligo6或Primer5给出的引物Tm值确定，其中7.0），室温或37放置2min（55-80洗脱效果更好）。8000r/min室温离心1min，离心管中的液体就是回收产物。（2）其它公司的试剂盒（如AXYGEN公司的AXYprep DNA Gel Extraction Kit）的操作步骤与上述大同小异，做实验时按照各家的产品说明书操作即可。8.可取2l-5l回收产物电泳，检测是否有回收到的目的DNA带。9.清理桌面，撰写实验记录。【思考题】1.为何避免用EB染色及用紫外灯照射欲回收的目的DNA？实验六目的基因

27、片段与载体连接【实验目的】学会DNA片断的体外连接技术。【实验原理】在Mg2+和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端连接成重组DNA分子。【实验用品】1.器材旋涡混合器，微量移液取样器，双面微量离心管架，台式离心机，干式恒温气浴，恒温水浴，泡沫塑料保温盒。移液器吸头和0.5mL微量离心管分别进行高压灭活。2试剂（1）T4 DNA连接酶（2）连接酶缓冲液（3）无菌dd Water等3材料（1）pMD19-T载体。NK PCR产物（2）EcoRI +BamHI酶切回收的pET-Trx载体。EcoRI +BamHI酶切回收的NK插入片断【实验方法】1.P

28、CR产物与T载体直接连接：（1）事先将干式恒温仪（或泡沫塑料保温盒里的水）温度调整到14C。（2）取一个高压灭活的0.5mL微量离心管，加入：PCR产物混合液 4mLpMD19-T载体 1mLT4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul） 0.5mL连接酶缓冲液 1mLdd Water 3.5mL总体积 10mL（3）将上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14C水中保温过夜。（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞（方法见实验八）或置4C冰箱备用。2.DNA回收片断（NK）与表达载体（pET-Trx）连接：（1）取一个灭菌的0.5mL微量离心管，加入：NK片段回收产物 4mLpE

29、T-Trx载体酶切回收产物 1mLT4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/uL） 0.5mL连接酶缓冲液 1mLdd Water 3.5mL总体积 10mL（2）将上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14C干式恒温仪（或14C水中）中保温过夜。（3）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞（方法见实验八）或置4C冰箱备用。【思考题】1.连接酶的最适活性温度是多少？2.为什么要采用14C下连接？3.如何确定插入片段的用量与质粒载体的用量？实验七感受态大肠杆菌的制备【实验目的】学会用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。【实验原理】细菌在0C的CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成

30、为容易吸收外源DNA的状态。【实验用品】1器材旋涡混合器，微量移液取样器，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，接种环。摇菌试管、三角烧瓶、移液器吸头和0.5mL微量离心管分别进行高压灭菌。2试剂（1）LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water搅拌完全溶解，用约200mL5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121C20min灭菌。（2）0.1 mol/LCaCl2溶液，121C20min灭菌后存放在冰箱。（3）无菌dd Water3材料E. coliDH5a，E. coli

31、BL21（DE3）【实验方法】1.取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2mL LB培养基（不含抗菌素！）。2.从超低温冰柜中取出DH5a菌种和BL21(DE3)菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2mL LB培养基的试管中，37摇床培养过夜。3.在超净工作台中取0.5mL上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37下250r/min摇床培养23h。4.取少量菌液测定OD590为0.375（0.40.6，细胞数108/mL，此为关键参数！）。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。如果有大型冷冻离心机则应当使用50mL离心管离心集菌和CaCl2

32、处理。5.将菌液分装到1.5mL预冷的无菌微量离心管中，于冰上放置10min，然后于4，5000r/min离心10min。6.弃上清，并将离心管倒置以倒尽上清液。加入1mL 冰冷的0.1 mol/LCaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。7.4，5000r/min离心10min。弃上清液后，用1mL 冰冷的0.1 mol/LCaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。8.4，5000r/min离心10min。弃上清液后，用200L 冰冷的0.1 mol/LCaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管50mL分装到0.5mL的无菌微量离心管中。9.分装好的感受态菌可以直接用作转

33、化实验（方法见实验八），或立即放入-80超低温冰柜中保藏（可存放数月）。以后用的时候每次用完一管，不可反复冻融。10.在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验记录。【思考题】1.制作感受太菌的过程中，应注意那些关键步骤？2.CaCl2溶液的作用是什么？为什么要冰冷的？实验八感受态细菌的转化【实验目的】学会用质粒DNA转化感受态受体菌的基本操作技术。【实验原理】质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42C短时间的热休克处理，促进其吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中筛选。如果转化成功，获得外源质粒的受体菌能够依靠质粒上的抗菌素

34、抗性基因在选择平板培养基上生长，没有获得外源质粒的菌体将被抗菌素杀死。【实验用品】1器材旋涡混合器，微量移液取样器，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，0.22m细菌滤器。培养皿、移液器吸头和1.5mL、0.5mL微量离心管分别进行高压灭菌。4试剂（1）LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water搅拌完全溶解，用约200mL5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121C20min灭菌。使用时可加入氨苄青霉素，终浓度100mg/mL。（2）氨苄青霉素储存液：

35、无菌水配制100mg/mL，每管200L分装到0.5mL微量离心管中，-20C保存。（3）LB平板培养基：LB培养基中含14%琼脂，高压灭菌后加入氨苄青霉素至100g/mL，每个培养皿中约15mL倒制平板。（4）无菌dd water（5）20%（M/V）IPTG：无菌水配制，过滤灭菌。（6）2%（M/V）X-gal：用N,N-二甲基甲酰胺配制，过滤除菌，铝箔封裹避光-20C保存。3材料感受态细菌，质粒【实验方法】1.事先将恒温水浴的温度调到42。2.从-80 超低温冰柜中取出一管（50L）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴510min。3.加入5L连接好的质粒混合液（DNA含量不超过

36、100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。4.轻轻摇匀后插入42水浴中12min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置35min。5.在超净工作台中向上述管中加入300L LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37震荡45min。6.在超净工作台中取上述转化混合液50300L（根据转化效率和载体连接效率而定），滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中。从酒精中取出玻璃涂布棒，在火上点燃，熄灭后稍等片刻，待其冷却后轻轻涂布均匀。7.如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40L 2% X-gal，7L 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。8.在

37、涂好的培养皿上做上标记，先放置在37恒温培养箱中约1030min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37恒温培养箱培养约18h。9.在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验记录。10.观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。挑选白色菌斑进行筛选和鉴定（方法见实验九）。【思考题】1.影响转化效率的因素有哪些？2.白色菌落出现的原理是什么？实验九转化克隆的筛选和鉴定【实验目的】学会用酶切法或PCR法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。【实验原理】利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。选

38、择一定数目的菌落接种培养后提取质粒，用载体克隆位点两侧的酶切位点进行酶切，如果切出预期的DNA片段，说明质粒上插入了外源DNA片段。也可以以提取的质粒为模板，或直接以选择培养基上的菌落得少量菌体为模板，用目的DNA片段两侧的引物进行PCR扩增，如果扩增出预期的DNA带，说明质粒上插入了目的DNA。【实验用品】1器材旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，PCR仪，恒温摇床，超净工作台，酒精灯。牙签、摇菌管、移液器吸头和1.5mL微量离心管分别进行高压灭菌。2试剂（1）LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL

39、 dd water搅拌完全溶解，用约200mL5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121C20min灭菌。使用时可加入氨苄青霉素，终浓度100mg/mL。（2）氨苄青霉素储存液：无菌水配制100mg/mL，每管200L分装到0.5mL微量离心管中，-20C保存。（3）LB平板培养基：LB培养基中含14%琼脂，高压灭菌后加入氨苄青霉素至100g/mL，每个培养皿中约15mL倒制平板。（4）无菌dd water（5）20（M/V）%IPTG：无菌水配制，过滤灭菌。（6）2%（M/V）X-gal：用N,N-二甲基甲酰胺配制，过滤灭菌。（7）50TAE电泳缓冲液（pH约8.5）：T

40、ris碱 242g，57.1mL冰乙酸，37.2g Na2EDTA2H2O，dd water 定容至1L。使用时稀释成1。（8）1000溴化乙锭储存液（0.5mg/mL）：50mg溴化乙锭溶于100mL dd water，4C避光储存。使用时在蒸馏水里滴入适量，使水看起来微微发红即可。（9）10加样缓冲液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝（10）6加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液（11）DNA分子量标准：lDNAHindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等。（12）电泳

41、级琼脂糖粉（13）3U/L Taq DNA聚合酶（14）10PCR缓冲液（MgCl2free）（15）25mMMgCl2（16）dNTP混合液（每种25mM）（17）无菌dd water（18）溶液 I 葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0（19）溶液 II（NaOH/SDS溶液)：0.2mol/L NaOH，1% SDS，现用现配（20）溶液 III KAc溶液（pH4.8）：60mL 5mol/L KAc，加冰乙酸调至pH4.8，补dd water至100mL（21）10mg

42、/mL RNase A：RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中（22）TE 缓冲液：10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0（23）95%和70%乙醇（24）EcoRI和BamHI内切酶，10内切酶缓冲液（25）65%甘油：65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris Cl pH8.03材料要鉴定的克隆，引物【实验方法】方法一：菌落快速PCR筛选法（选做）1.在转化的平板培养基上随机选取3个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。2.在0

43、.2mL PCR微量离心管中配制25L反应体系（方法参见实验四）。 dd water 16L10PCR buffer（不含MgCl2）2.5L 25mM MgCl21.5L 2.5mmol/L dNTP 2L（每种dNTP终浓度0.2mM） 10mol/L Primer1 1L（12.525pmoles） 10mol/L primer2 1L（12.525pmoles） Taq酶 0.5L（1.5u） 模板质粒：用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，伸入PCR混合液中洗一洗总体积 25L3.根据PCR仪的操作手册设置PCR仪的循环程序： （1）94C5min（2）94C 1min（3）60C

44、1min（根据引物的Tm值设定）（4） 72C 1min50s（根据所扩增的DNA的长度设定）（5）go to（2）29 times（6）72C10min4.PCR结束后，取10L产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片断同时电泳）。观察胶上是否有预计的主要产物带。5.按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取其质粒6.提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳（方法见实验二）筛选，然后用内部引物进行PCR的鉴定，或用酶切进一步确认。方法二：酶切鉴定1.在转化的平板培养基上随机选取3个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。2.在超净工

45、作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mL LB（含100mg/mL氨苄青霉素），用记号笔写好编号。3.在超净工作台中将70%乙醇浸泡过的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mL LB（含100mg/mL氨苄青霉素）的摇菌管中。4.37摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒（方法见实验一）。摇菌管中的剩余菌液暂保留在4冰箱中。5.将提取到的3管质粒样品与已知分子量的质粒同时电泳（方法见实验二），先根据分子量判断和选取有插入片段的质粒。6.然后用适当的酶切（方法见实验三）7.酶切产物与目的片段一同电泳（方法见实验二）来进一步鉴定其上

46、的外源插入片断大小是否与预期相符。8.将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500mL菌液与500mL65%甘油混合后-80保存菌种。9.在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验记录。【思考题】1.PCR法筛选的优点和缺点是什么？2.酶切法与PCR法筛选方案哪个更可靠？3.最终确认克隆的方法有哪些？实验十外源基因的诱导表达【实验目的】了解外源基因在原核细胞中表达的特点和IPTG诱导表达的方法。【实验原理】外源基因克隆在含有T7启动子的表达载体pET-Trx中。lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外

47、源基因转录。在没有诱导剂的条件下先让宿主菌生长，等到细菌进入最佳生长状态，向培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-b-D-半乳糖），与阻遏蛋白结合解除抑制，使整合在BL21（DE3）基因组中的T7 RNA聚合酶表达，从而启动表达载体pET-Trx上的外源基因大量表达。表达的蛋白可用SDS或Western-blotting检测。【实验用品】1器材旋涡混合器，微量移液取样器，双面微量离心管架，台式离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，接种环。三角烧瓶、摇菌管、移液器吸头和1.5mL微量离心管分别进行高压灭菌。2试剂（1）LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC

48、l 10g，加200mL dd water搅拌完全溶解，用约200mL5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121C20min灭菌。使用时可加入氨苄青霉素，终浓度100mg/mL。（2）氨苄青霉素储存液：无菌水配制100mg/mL，每管200L分装到0.5mL微量离心管中，-20C保存。（3）无菌dd water（4）100mg/mL（M/V）IPTG：无菌水配制，过滤除菌（5）20%葡萄糖：8磅灭菌20分钟。使用时添加至LB中，终浓度为0.2%3材料 pET-Trx-NK重组载体及空pET-Trx转化的BL21（DE3）菌株，对照BL21（DE3）菌株【实验方法】1.在超净

49、工作台中接种含有pET-Trx-NK重组载体的BL21（DE3）菌、BL21（DE3）空菌、空pET-Trx转化的BL21（DE3）菌，培养于1.5mL LB-葡萄糖培养基（含抗菌素Amp 120g/mL）的摇菌管中，37C摇菌至OD600=0.5，此为关键）。2.按下列组合用IPTG进行诱导表达：BL21（DE3）空菌不加IPTGpET-Trx转化的BL21（DE3）菌 加IPTG至100mg/mLpET-Trx-NK转化的BL21（DE3）菌加IPTG至100mg/mL3.150170r/min37C摇菌1.53h。4.10004000r/min离心15min，弃掉上清液，收获菌体。5.菌

50、体可以进行SDSPAGE电泳分析（见实验十一），也可放在-20C保存备用。6.在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验记录。【思考题】1.IPTG的作用原理是什么？2.为什么要增加抗菌素的用量？实验十一SDS检测表达蛋白【实验目的】学习SDS胶的基本灌制方法和用SDS检测表达蛋白。【实验原理】蛋白质在加热变性以后与SDS结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结果按分子量大小排列在胶板的不同位置上，经考马斯亮兰染色后可观察到蛋白质带。含量多的蛋白带纹粗含量少的带细。根据目的基因在载体上从起始密码至终止密码的编码碱基数目估计表达产物的分子量（1kb DNA约相当于3.7104道

51、尔顿蛋白质）。【实验用品】1器材旋涡混合器，微量移液取样器，双面微量离心管架，台式离心机，制冰机，超声波破碎仪，电磁炉，电泳仪，垂直电泳槽及配套的玻璃板、夹子、密封条、梳子等，pH计，电磁炉，带盖的搪瓷盘。移液器吸头和1.5mL微量离心管分别进行高压灭菌。2试剂（1）1.0mol/L Tris HCl pH8.8：称取12.1gTris碱,加50mL蒸馏水，缓慢地加浓盐酸至pH8.8（约加8mL）。让溶液冷却至室温，pH将会升高，然后再调至pH8.8，加蒸馏水至100mL。高温高压灭菌后4C保存（2）0.5mol/L Tris HCl pH6.8：称取6.05gTris碱溶于40mL蒸馏水中，

52、加约48mL 1mol/L HCl，让溶液冷却至室温，再用HCl调至pH6.8，加水稀释到100mL终体积。高温高压灭菌后4C保存（3）10%SDS：蒸馏水配制，室温保存（4）30% Acr（丙烯酰胺）/Bis（N,N-亚甲基双丙烯酰胺）：30gAcr+0.8g Bis，用dd water定容至100mL，4C棕色瓶避光保存，可用一个月（5）10%Aps（过硫酸氨）：蒸馏水配制，-20C保存。过硫酸铵会缓慢分解，一周内使用完。（6）2上样缓冲液：0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2mL，甘油2mL，20%SDS 2mL，0.1%溴酚蓝0.5mL，b-2-巯基乙醇1.0mL，dd

53、water 2.5mL，室温存放（7）5电泳缓冲液：Tris 7.5g，甘氨酸36g，SDS 2.5g，加dd water至500mL。使用时稀释5倍（8）TEMED（(N,N,NN-四甲基乙二胺）（9）低分子量蛋白分子量Marker：97.4，66.2，43，31，20.1，14.4 kDa（10）考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g + 45mL甲醇+10mL冰醋酸，用dd water定容至100mL（11）脱色液：95%乙醇/冰醋酸/水= 4.5/0.5/5（体积比）3材料IPTG诱导表达的菌体。【实验方法】1.将表达后的菌体与2上样缓冲液按1：1混匀于微量离心管中。2.（此步可省略）用超声波破碎仪脉冲10次，每次10秒。中间间隔时放入冰中降温。注意一定要将超声波探头插入容液底部，在溶液表面或上部时容易起泡！3.将上述微量离心管用封口膜封住管盖，插入水漂中，放在电磁炉锅里的沸水中煮35min。然后立即插入冰中