青年基金浦东新区上呼吸道病毒感染的病原谱研究

1、浦东新区卫生局卫生科技项目实施计划书项目名称：浦东新区上呼吸道的病原谱研究类别：_青年基金_：承担：_市浦东新区疾病预防控制中心（盖章）/ 项目：起止时间：2012.1.1-2013.12.31浦东新区卫生局2010 年版填表说明一、此项目实施计划书请使用 A4 普通纸张双面打印填报，正文内容请用宋体小四号字填写，间距为 1.2-1.5 倍行距。各栏空格不够时，请自行加页。左侧装订成册（不要采用胶圈、文件夹等带有突出棱边的装订方式）。二、此项目实施计划书各项内容要实事求是，逐条认真填写，外来语同时用原文和中文表达。三、此项目实施计划书一式六份，经正式审定后，与合同书、开题组成基础资料，并妥善保

2、存以备用。一、基本情况研究项目名 称浦东新区上呼吸道的病原谱研究类 别面上项目 青年基金重点协作初级卫生特色专科附带主攻课题研究起止时间2011 年 1 月 1 日至 2013 年 12 月 31 日申请经费1 （万元）匹配经费 1（万元）项目负责人男出生年月1981-8学历学位/职务主管工作市浦东新区疾病预防控制中心科室/部门微生物检验科从事专业微生物检验承担单位序名称通讯地址1市浦东新区疾病预防控制中心市浦东新区3039号研究项目摘要研究内容和预期成果摘要（限 300 字）：上呼吸道是引起感冒、流感等临床疾病的主要病原，严重是可引起、哮喘等疾病。常见的呼吸道有流感、鼻、副流感、呼吸道合胞等

3、，并且有越来越多的新或新亚型被发现，如偏肺和博卡 。本研究通过呼吸道多重 PCR 方法及毛细管电泳技术，了解本地区类流感样 中呼吸道 的 情况及各 的流行特征。本研究有助于了解 性呼吸道疾病的病原谱 情况、各 的流行病学特征和规律。为冬春季 性呼吸道疾病的防控工作提供依据，为不明原因发热的病原确定提供 结论。同时，为各 的进一步研究打下基础。 1-2 篇。二、立题依据（包括国内外研究现状、水平和发展趋势、经济建设和社会发展需求，当前须解决的主要问题、学术价值等，附主要参考文献）呼吸道 是人类最常见的 性疾病，有着较高的患病率和 率。据世界卫生组织（World Health anization，

4、WHO） ，呼吸道 是造成低收入国家儿童 的第一 ，也是世界范围内 5 岁以下儿童 的第二大原因。儿童每年大约有 6-9 次呼吸道 ，成 约有 2-4 次。上呼吸道 的实际损失难以估算，尤其是 抗生素、缺课和误工的 。下呼吸道 要比上呼吸道 少，但是有 1%-13%的下呼吸道 需要住院治疗。这些患者的花费较高。例如，儿童下呼吸道 的费用每年超过 24 亿 1。大多数呼吸道 是由 引起的，常见的呼吸道 有流感（ Human Influenza，HIF）、副流感（Parainfluenza，PIV）、人鼻（Human Rhino，HRV）、冠状（Corona，CoV）、呼吸道合胞（Respirat

5、ory Syncytial，RSV）、偏肺(Metapoes，MPV)，博卡Boca， BoV）等。由于检测技术等原因，许多呼吸道的病原不能被找到，导致许多呼吸道不能被确诊。随着检测技术和分子学的发展，越来越多的呼吸道被鉴定和研究，如博卡等；许多的新亚型被发现，如 C 型人鼻HRV-C）、4 型副流感（PIV-4）等；许多的变异株被鉴定，如 SARS 冠状（SARS-CoV）、新甲型流感A ()等。 Arden 等2研究发现人鼻、人腺、人偏肺、人博卡以及人冠状是澳大利亚布里斯班急性呼吸道的主要病原。在预实验中，在本地区上呼吸道样本中检测到了除博卡病毒以外的所有。因此有必要对呼吸道病原的病原类型

6、、分布特点等进行研究。对于的及时，有以下 5 个方面的益处。第一，预后。越来越多的表明是混合病原中的一种。例如，一个在性疾病部的社区获得性可能分离到流感杆菌，但是同样可以分离到 2 型副流感3。70%的婴儿在第一年中会RSV，而大部分的小孩在 2 岁之前至少会被 RSV一次。有 20-30%的婴儿初次RSV 是典型的重症，引起支气管炎等下呼吸道疾病。而 HRV 也会下呼吸道。的分子技术增加了 HRV 引起支气管炎的4。HRV 与 RSV 的共会引起更严重的疾病。虽然快速多重呼吸道检测只是分子方法检测阳性。但是，对于患儿的治疗却给出了依据，治疗将更加对症。例如，同治疗 RSV一样，HRV的治疗需

7、要系统的皮质类固醇药物来减少周期性哮喘。因此，有助于理解和预断是什么导致了住院或者需要延长住院时间（例如或严重的下呼吸道疾病）。多重病原的检测可提示比较严重，治疗的时间需要延长。第二，治疗临床的并发症。因流感而患上社区获得性可继发细菌性。继发的细菌性是引起流感相关的重要。Scadding5了 19 个 中有 7 个 因为继发细菌性 而 的事件（致死率为 37%） Nicholson6 的 率达到了 50%。尽管抗菌治疗是治疗的标准，抗 治疗由于细菌性 的自愈特点而被忽略。因流感并继发细菌性 而导致 与肺炎导致 的总相似性较高且并不受抗细菌效果的影响。McCullers7对大鼠的研究表明，用特异

8、性的 神经氨酸酶抑制剂来治疗易患流感 者能改善抗生素的效率并增加那些对流感 导致的并发症和 患者的存活率。快速有效的对于这种治疗的决策是关键。当灵敏的筛选需要在住院后数小时内完成时，分子方法因其样本处理方便及敏感性高而更加具有优势。第三，预防疾病的。呼吸道易于在密闭的空间内 。丰富的呼吸道种类增加了的机会，尤其是儿童间的总是导致大量的患儿。哪种/哪些以及谁是密切接触者的信息可以指导用于预防或者的抗药物的使用。如果一个慢性心脏病儿童RSV 的风险增加，那么 可用以预防 RSV引起的许多严重并发症。同样的，如果在血液内一个 被检测到感染了 3 型副流感，那么这个必须被以防这个中的 进一步。 200

9、5 年一起在新生儿加护内的 RSV 暴发在被控制和结束前，导致了 9个婴儿。暴发使医院的直接损失超过 115 万，主治医生认为如果在开始出现症状的时候就出 RSV，所附的代价就不会那么严重。这个教训使得现在所有的新生儿加护内，冬季一旦有人出现咳嗽、咽喉充血或呼吸都必须检测 RSV 和其他呼吸都8。SARS 和例证了呼吸道检测是一种预防的方法。快速检测 SARS冠状 以及使得采取适当的治疗成为可能。对季节 毒的检测使得对于 SARS 和其它等临床难以区分的病例的变得有选择。Louie 等9了疑似 SARS 的最普通的病例，在所有疑似 SARS 的病例中有 45%被为普通的季节毒，因而这些可以排除

10、 SARS。第四，治疗。对流感的早期可以改善抗药物的防治效果并且对药物治疗费用的合理性有很强的影响。用神精氨酸酶抑制剂治疗流感需要在 48 小时内用药，因此 结果必须快速。Gonzales 等10在对呼吸道的抗生素使用情况进行了检查。根据细菌性中耳炎、鼻窦炎、咽炎、支气管炎和上呼吸道的的患病率，对理想的抗生素使用率进行了估算。超过四千一百万张抗生素处方中，二千二百六十万张（占 55%）评估的法定处方是没有细菌引起的。因此，抗生素的代价不菲。微生物的可能对减少抗生素的和可能的抗生素使用有着重要的影响10。对欧洲 26 国的一项非抗生素使用的发现， 在抗生素使用量较高的国家，医生对抗生素的使用更倾

11、向于广谱的抗生素，导致了疾病对抗生素的抗性也越来越高11。过量使用抗生素，尤其是对的大量使用，将增加了临床对抗生素使用的限制以及引起抗生素抗性增加的风险。分子技术提供的病原检测的及时鉴定信息有助于临床医生对药物的选择，从而使 和社会获益。第五， 监测和 。分子 在流感流行和大流行的应对以及高致病性毒株变化的监测中起到重要的作用。实时检测可用于人或动物 或监测，许多国家在社区有中心来提交样本给 来获得 中流 亚型变化的信息，而且这个信息可以指导今后的 政策。总之，呼吸道的分子可以提供及时精确的结果，检测到新型和已知的，帮助理解在特定中病原的功能，指导治疗和院内的管理，使监测和政策更加优化。核酸扩

12、增方法（PCR，Polymerase chain reaction）等一系列分子技术提供了及时、快速，可依赖的方法。随着 PCR 方法的发展，实时荧光 PCR（real-time PCR）、巢式 PCR（nest PCR）、多重 Pultiplex PCR）等快速、敏感的方法越来越多的被用于疾病，特别是的12。对于病原众多的呼吸道来说，多重 PCR 是检测呼吸道的最佳选择，通过在一个反应管中加入对多特异性引物，经 PCR 扩增，就可以检测多种目的的条带。因而具有通量大，省时的特点。目前已经有 seeplex、Luminex、X-TAG RVP、ResPlex 及 MultiCode-Plex

13、等多种多重呼吸道检测试剂可供选择并且有做比较13。毛细管电泳技术因没有制胶过程、不存在 EB 污染获得结果时间比普通电泳短等优点，在生物、医学等领域受到越来越多的应用14,15,16。总之，通过多重 PCR 方法检测呼吸道患者的样本，将使医生在第一时间获得病原的信息，使得疾病在一开始就得到正确的处理，避免了额外的抗生素使用，从而缩短了的康复时间，降低了的医疗费用。医院也可以提高床位的利用率，缓解床位紧张。参考文献：1 Henrickson KJ. Cost-effective use of radiagnostic techniqueshetreatment andprevention of

14、viral respiratory infections. Pediatr Ann. 2005, 34:24312 Arden K E, McErlean P, Nissen M D et al. Frequent detection of human rhinoes,paramyxoes,coronaes,andbocaesduringacuterespiratoryinfectionsJ. Journal of medical virology. 2006, 78:1232-12403 Templeton KE, Scheltinga SA, vanden E, et al. Improv

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20、ratory viral infections in adults. J. Clin. Virol. 2011,50(1), 4245Santiago P, Raquel M-H, Lourdes P, et al.South American native bumb ees (Hymenoptera: A ae) infected by Nosema ceranae (Microsporidia), an emerging pathogen of honeybees (Apis mellifera)J Environmental microbiology. 2009:1-5g CC, Lee

21、 CN, Lin CY, et al. Identification of deletion and duplication genotypes of the PMP22 gene using PCR-RFLP, competitive multiplex PCR, and multiplex ligation-dependent probe lification: A comparisonJ. Electrophoresis. 2008, 29:618-625Akiyama H, Sakata K, Kondo K, et al. Individual Detection of Geneti

22、cally Modified Maize Varieties in -Identity-PMaize S lesJ J. Agric. Food Chem. 2008, 56: 19771983三、项目实施方案研究的总体目标和拟解决的关键问题。总体目标：了解本地区呼吸道的病原情况了解本地区呼吸道的流行病学特征及规律拟解决的关键问题：本地区上呼吸道的主要病原各上呼吸道的流行特征及规律研究内容、技术路线和方案方法。研究对象本研究的研究对象为类流感样病例。其中，流感样病例的定义为发热 38以上，有咳嗽、咽痛、全身酸痛之一的病例。样本的来源及数量标本主要为流感检测哨点医院东方医院和医院的类流感样病例的

23、鼻咽拭子，每周。呼吸道 的病原 研究通过呼吸道多重PCR 方法结合毛细管电泳技术，对呼吸道标本进行检测，检测流感 （HIF）、副流感 （PIV）、人鼻 （HRV）、冠状 （CoV）、呼吸道合胞 （RSV）、偏肺 (MPV)，博卡 （BoV），肠道 （EV）的情况。并对流感的A/B 亚型，副流感的 1-3 型、冠状OC43、NL63、 HKU1、229E，呼吸道合胞A/B 组进行型别上的区分。本地区呼吸道 的流行情况分析通过病例信息和实验结果分析，了解本地区呼吸道的流行情况以及各的流行情况。 数据分析运用 9699 进行统计分析，包括基本数据统计和描述等。技术路线：病原谱分析及流行病学分析毛细管

24、电泳检测结果的多重 PCRcDNA 的标本核酸的提取标本的收集、登记、保存四、考核指标和预期成效预期的项目成果、考核指标及提供成果的形式（包括主要技术指标、形成的专利、标准、新技术、新产品、新装置、专著等数量、指标及其水）。了解本地区呼吸道的病原情况了解本地区呼吸道的流行特征和分布情况期刊12 篇预期的社会、经济效益和应用价值。为冬春季呼吸道疾病的防控提供依据为不明原因发热的提供依据，为暴发前提供信息减少患者的经济负担，提高患者的生活质量其他。五、年度计划及年度目标（按 6 个月为时间节点填写）时间安排工作内容阶段目标2011 年 1 月至 2011 年 6 月样本的收集收集样本2011 年

25、7 月至 2011 年 12 月样本的收集、检测完成预实验2012 年 1 月至 2012 年 6 月样本的收集及检测完成检测2012 年 7 月至 2012 年 12 月检测数据的汇总，本课题应于 2013 年 1 月 1 日前进行验收六、项目实施基础1与本项目有关的研究工作积累和已取得的成绩。1.1 课题第一于 2010 年和 2011 年先后 2 次到中国疾病预防控制中心病所进行为期 3 个月的进修。学习了呼吸道标本的处理、呼吸道的多重 PCR方法、毛细管电泳技术、等本课题相关的技术和方法。1.2对 2010 年 7 月2011 年 6 月间 476 例浦东新区类流感样病例的检测发现，有

26、143 例是流感，8 例是副流感，6 例是呼吸道合胞，10 例是冠状，14 例是腺、17 例是鼻、3 件是偏肺病毒，总阳性率为 29.83%（142/476）。1.3本中心流感网络最早的 42 家流感网络之一。具有很强的流感核酸检测及分离能力。1.4近期流感的监测和检测未检出流感，凸显出其它呼吸道是主要的病原。在几起相关的性发热事件中，检出 HRV 及 RSV导致的发热情况。1.5和专利文章：飞、.市浦东新区 2010-2011、年手足口病检测情况分析. 中国初级卫生. 2011,25(11):64-66, 章红红. 2007 - 2009市南汇区副溶血性弧菌的检出情况分析. 疾病监测. 20

27、10, 25 (9): 702-704.谷氨酰胺工程应用研究进展.，酶植物农业科学. 2007，1：106109.市南汇区致病性弧菌分析. 疾病监测.，2009, 24 (5): 340-342专利：、. 一种提高植物氮素营养利用率、载体与应用P.中国专利：200710066405，20080625的. 叶绿体型谷氨酰胺、酶的植物表达载体及其构建和应用P. 中国专利：200810233624，20090422七、意见研究课题若涉及问题，需经所在提出意见。不涉及医学问题签章公章年月日、拟南芥细胞质型谷氨酰胺酶的植物表达载体的构建和应用 A6C 中国 专利 ： ， 已具备的实验条件、尚缺少的实验条件和拟解决的途径。微生物检测 具备国家 认可和计量