分子遗传学第七章课件

1、分子遗传学第七章分子遗传学第七章 2 经典的遗传标记（1）形态遗传标记 能用肉眼识别和观察的、明显表现出遗传多样性的体型外貌特征，称为形态遗传标记。例如，动物的毛色、角形、耳型、体型、外貌等。 优点简单、直观。 缺点标记数目少、多态性低、受等位基因的相对效应、非等位基因的相互作用以及环境等因素的影响。 2 经典的遗传标记 （2）细胞遗传标记 染色体核型（染色体的数目、大小、随体、着丝粒位置、核仁组织区等）、带型和数量的变异,呈现出的染色体在结构上和数量上的遗传多态性称为遗传标记。 优点不受环境影响，呈孟德尔方式遗传。 缺点工作量大，多态性较局限，常伴有对生物有害的表型，获取材料困难。 （2）细

2、胞遗传标记 （3）免疫遗传标记 以动物的免疫特征为标记，包括红细胞抗原多态性和白细胞抗原多态性。 红细胞抗原多态性红细胞表面有很多血型特异抗原，不同的血液型有不同的血型特异抗原。例如ABO型、MN型等。 白细胞抗原多态性主要组织相容性（MHC）是最复杂、最具多态性的体系。猪的MHC用SLA表示，牛的MHC用BLA表示。 （3）免疫遗传标记 （4）生化遗传标记 以蛋白质多态性为标记。蛋白质多态性是指具有相同功能的蛋白质存在两种以上的变异体。这些变异体在电泳时迁移率有差异，据此区分为不同的“型”。 同一种蛋白质存在的遗传多态性称为蛋白质型。由于共显性和中性的多态性在数量上有限，而且有些多态性是电泳

3、方法检测不出的，因为氨基酸取代不产生电荷的变化。 （4）生化遗传标记3 分子遗传标记 分子遗传标记是以DNA多态性为基础的遗传标 记，又称DNA分子标记或多态性DNA标记。 自20世纪70年代以来，随着分子生物学的发展，相继建立了多种分子遗传标记检测技术，例如，RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等。 分子遗传标记的特点：遗传多态性高；检测方法简单快捷；遗传共显性，能分离出等位基因的三种基因型。3 分子遗传标记 二 RFLP标记 限制性片段长度多态性（restiction fragment length polymorphism,RFLP）是1980年建立的第一代遗传标记。RFLP是

4、指用限制性内切酶切割不同个体的DNA时，会产生长度不同的DNA片段，电泳后用克隆探针方法可检测出这些片段。 其基本过程是：取得DNA样本酶切电泳转移至硝酸纤维膜上DNA探针杂交放射自显影。 二 RFLP标记图7-1 限制性片段长度多态性（RFLP）图7-1 限制性片段长度多态性（RFLP）图7-2 Southern杂交法图7-2 Southern杂交法图7-3 RFLP检测图7-3 RFLP检测 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）：1985年建立的一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。 PCR 原理：在反应温度为9095时，DNA变性成为单链

5、；反应温度降至4565时，两种引物与两条单链DNA退火而配对结合；反应温度升至72左右时，在TaqDNA聚合酶作用下，引物以单链DNA为模板逐步延伸成新的单链。“ 变性退火延伸”这一循环完成后，DNA复制了一次，由一个DNA分子成为两个DNA分子。 聚合酶链式反应（polymerase chai图7-4 DNA扩增原理图7-4 DNA扩增原理 PCRRFLP 如果已知多态性位点周围的DNA序列，则可用PCR快速而简单地进行RFLP分析。 首先根据多态位点两侧序列设计和合成引物；以基因组DNA为模板进行PCR扩增；用相应的内切酶进行消化；再进行电泳，分析PCR区带判断多态性。 PCRRFLP 图

6、7-5 PCRRFLP图7-5 PCRRFLP 应用举例苯丙酮尿症的基因诊断 苯丙酮尿症是由于苯丙氨酸羟化酶（PH）基因异常引起的常染色体隐性遗传病。Msp酶对PH基因区进行酶切，以分离到的PH cDNA为探针，对人群进行RFLP分析，不同个体基因组产生23kb和19kb的片段。存在23/23、19/19、23/19三种基因型。 例：23/2323/19 23/23 （患儿）， 23/19 （正常） 表明致病基因与23KbDNA相连锁；正常PH基因与19KbDNA相连锁。 该夫妇又怀孕，胎儿为23/19。19Kb片段来自母亲，此片段与正常基因相连；23Kb片段来自父亲，此片段可能与正常基因相连

7、，也可能与突变基因相连。该胎儿的PH位点基因型为 +/+ 或 +/- 。隐性纯合体的可能性排除，表型正常。 应用举例苯丙酮尿症的基因诊断图7-6 苯丙酮尿症的基因诊断图7-6 苯丙酮尿症的基因诊断 RFLP的局限性 提供的信息量有限。基于核苷酸改变产生的酶切位点变化只有“能切”和“不能切”两种状态，产生的酶切片段一般只有2-3个。 有些核苷酸改变不能用限制性内切酶检出。 探针制备和使用同位素存在费用和环境问题。 RFLP的局限性 三 小卫星标记 基因组中有一种重复序列称为小卫星DNA（minisatellite DNA） 或称为同向重复序列可变数（variable number tandem

8、repeat ， VNTRs ）区。 不同个体和基因组的不同位点上，VNTRs数目都不同。 1985年，A.Jeeries 在人肌红蛋白基因第1内含子中分离出132bp的重复序列，内含4个重复单位，每单位长33bp，内有13bp为核心序列（GGAGGTGGGCAGG）。 用由核心序列重复排列而成小卫星DNA做探针时，与基因组DNA杂交，可产生含多条区带的杂交图谱。这种图谱表现出高度的个体特异性，称之为DNA指纹（DNA fingerprint）。 三 小卫星标记图7-7 VNTR的多态性图7-7 VNTR的多态性图7-8 DNA指纹图7-8 DNA指纹 DNA指纹的特点 标记性 群体中VNTR

9、存在多态性，可以作为等位基因的一种标记。即A和a一对等位基因所连锁的VNTR可能是不同的，因次可以通过鉴别不同的VNTR作为标记来确定A和a。 多座位性 基因组中有很多小卫星座位，一个小卫星探针可与多个小卫星座位上的等位基因杂交，产生具有很多条带的杂交图谱，每个条带代表一个等位基因。 DNA指纹的特点 高变异性 DNA指纹图所检测的座位是基因组中有很高变异性的座位，所以由多个这种座位上的等位基因所组成的图谱必然有很高的变异性。变异的原因可能是个体的等位基因连锁着不同数目的重复单位，在减数分裂时它们之间可以发生重组，产生新的组合。 用探针33.15进行DNA指纹分析时,两个无亲缘关系的人具有相同

10、DNA指纹的概率为310-11,而同时用33.15和33.6探针分析,概率则为510-19 。 简单而稳定的遗传性 呈孟德尔遗传，亲代图谱的条带独立地分配给子代，子代图谱中的每一条带都可以在双亲中找到。还具有体细胞稳定性，用同一个体不同组织做的指纹图是相同的。 高变异性 DNA指纹图所检测的座位是基因组 四 微卫星标记 基因组中有一种重复序列称为微卫星DNA（microsatellite DNA） 或称为短串联重复（short tandem repeat，STR）序列。重复单位为26bp。 以微卫星DNA标记两侧特异性序列设计专一引物，通过PCR扩增微卫星片段，扩增产物经电泳分离，不同个体间因

11、核心序列的重复次数不同而产生DNA多态性。 四 微卫星标记图7-9（1）VNTR的多态性图7-9（1）VNTR的多态性图7-9（2）微卫星DNA多态性图7-9（2）微卫星DNA多态性图7-10 微卫星在家系中的检测结果图7-10 微卫星在家系中的检测结果 微卫星标记的优点 高度的多态性 由于（CA）等重复序列不受进化上选择，因而在同一位点中数目变异很大，在群体中，可因重复次数不同可形成多达几十种的等位片段（多态性）。 作为遗传标记的高频率性 这样的位点在基因组中出现的频率很高，而且分布很广。 采用PCR技术自动化操作 因为重复序列两侧的特异性拷贝可作为其在基因组中定“点”的标记。 微卫星标记的

12、优点 微卫星标记的应用 微卫星DNA分布广泛均匀，多态信息含量丰富，呈共显性遗传，稳定性好，可比性强，分析技术易实现自动化，是一种理想的分子标记。在人类和哺乳动物DNA分子连锁分析中已取代RFLP，成为第二代分子标记而被广泛应用。 微卫星标记的主要缺陷在于，必须事先了解微卫星的两翼序列才能设计引物，这就需要进行基因文库构建、分子杂交、筛选阳性克隆和DNA序列分析等，标记开发成本高。 微卫星标记的应用 五 单核苷酸多态性标记 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism ,SNP）标记是1996年开发的第三代遗传标记。 SNP与RFLP、STR等标记不同之处在于不

13、以“长度”差别为检测手段，而是直接以序列的变异作为标记。 在一个群体中，基因组的某一座位上可以有两个或以上的等位基因，这是等位基因多态性。 在基因组内某一特定的核苷酸位置上，也可以有不同的核苷酸。基因组中单核苷酸的置换使得群体中基因组的某个位点存在差异，如同等位基因那样可以有两个或以上的核苷酸。 五 单核苷酸多态性标记 SNP就是指基因组内特定的核苷酸位置上存在两种以上不同的核苷酸，其中最少一种在群体中的出现频率不少于1%（低于1%则视为突变）。 DNA双链中的一条链上某核苷酸发生置换时，其互补链的对应位点也发生核苷酸发生置换，只计为一个单核苷酸多态。 基因组中单核苷酸的缺失、重复、插入不属于

14、SNP。 核苷酸有4种置换方式，理论上SNPs有两种、三种、四种多态形式，但实际上三等位型和四等位型几乎无法检出，所以SNP一般为双等位型多态标记。如一个SNP把AAGGCT改变为TAGGCT。 SNP就是指基因组内特定的核苷酸位置上存在 SNP是出现频率最高的标记，人类基因组中平均每1000 bp中就有1个SNP，总数可达300万个。 SNP 既能在编码基因也能在非编码基因中发生，在编码基因中出现的称为cSNP，这种cSNP可能会影响蛋白质的结构和表达水平，对分析基因与性状的关系有重要意义。 由于编码序列选择压力大，杂合度可能性要小一些。而非编码序列（HLA）杂合度达5-10%。 SNP是出

15、现频率最高的标记，人类基因组中平均每1 就整个基因组而言，两个不同个体之间，约有几百万个碱基的差异，这相当于在蛋白组中有10万个氨基酸的差异。 SNP是单碱基突变，任何用于单碱基突变的技术都可用于SNP检测，如RFLP、DNA序列分析、单链构象多态性（SSCP）等，但这些技术必须通过淀粉凝胶电泳检测，费时而且效率不高。但随着微阵列DNA芯片（DNA chip）技术的发展，SNP检测效果得到大大提高。 就整个基因组而言，两个不同个体之间，约有几百万个碱 DNA芯片技术 原理:DNA芯片为面积为2cm2或更小的芯片。芯片上铺有密集的具有特定碱基序列的探针。将待测的DNA切成长短不一的片段，经荧光物

16、质标记后，注入嵌有芯片的载片上，由于DNA和探针的杂交程度与荧光强度有关，通过激光扫描即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。 六 几种分子遗传标记简介（一）随机扩增多态性标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是1990年建立的技术。 原理 人工随机合成DNA引物，以被测材料DNA为模板，在PCR仪中随机扩增。 引物在真核基因组（模板DNA ）中可能有很多结合位点，但只有在大约2000bp内存在反向平行的、与该引物互补的双链DNA分子，才能将合成的新链作为下一次合成的模板。 六 几种分子遗传标记简介（一）随机扩 方法引物：G+C含量不低于40%-50%

17、；5和3端的碱基顺序非反方向对称；长度以10bp为宜。扩增：变性复性延伸；3040循环；保温。电泳： 凝胶电泳；EB染色；拍照。分析：与RFLP相同。 优点技术简单；标记数目多；样品用量小；无须预先知道DNA序列。 缺点重复性较差；大部分为显性分子标记，不能在F2区分纯合体和杂合体，必须进行F3分析。 方法引物：G+C含量不低于40%-50%；5和3端（二）扩增片段长度多态性标（amplified fragment length polymorphism，AFLP ）是1993年建立的技术。 原理 对基因组DNA进行酶切片段的选择性扩增。使用双链人工接头与基因组DNA酶切片段相连接，作为扩增反

18、应的模板，通过接头序列与基因组DNA引物3端的识别进行选择性扩增，特异性片段经变性、退火和延伸，经36循环而得到扩增，最后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离而的以显示。（二）扩增片段长度多态性标（amplified fragm 方法（1）提取DNA样本，选择6个碱基识别位点的限制酶进性酶切；（2）酶切片段与特定的接头相连接；（3）利用磁珠在STEX盐溶液中洗脱，选择带有接头的特异性引物；（4）PCR前扩增；（5）同位素标定PCR引物；（6）PCR扩增；（7）在含尿素的聚丙烯酰胺凝胶上电泳；（8）凝缴转移至滤膜、干胶；（9）X光片上感光、冲洗胶片、结果分析。 方法（1）提取DNA样本，选择6个碱基识

19、别位点的限制酶 优点 多态性丰富，不受环境影响，无复等位效应；带纹丰富，用样量少，灵敏性高，快速高效。 一个0.5mgDNA样品可做4000个反应,获得8000个标记,650万条带纹. 优点 多态性丰富，不受环境影响，无复等位效应 某一DNA片段的互补单链如果发生了点突变，能通过非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，把突变单链与原来的正常单链分离出来。由于单核苷酸的改变会影响它的构象，单链构象改变会进一步影响在凝胶中的迁移率，为此能通过电泳区分不同的单链。（三）单链构象多态性标记（single-strand conformation polymorphism，SSCP ）是1993年建立的技术。 原理 某一DNA片段的互补单链如果发生了点 方法（1）在50ng基因组DNA进行PCR时，先将一对引物中的任何一个于5端标记 32P ，或者也可以在4种dNTP之一标记32P 。（2）在PCR反应混合液中取出1l放入100 l含有95%甲酰胺的10 mmol/L EDTA中，加热到80C，5min双链变性。（3）将含单链DNA片段的1 l溶液进行5%6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳。（4）放射自显影，从自显影谱中