植物生物技术第十二章植物遗传标记与分子标记图谱构建课件

1、植物生物技术第十二章植物遗传标记与分子标记图谱构建植物生物技术第十二章植物遗传标记与分子标记图谱构建2本章重难点遗传标记的发展DNA标记多态性的分子基础各类分子标记的原理及分析流程 遗传图谱的构建 分子标记与遗传连锁图谱的应用4本章重难点遗传标记的发展3第一节 遗传标记 (Genetic marker)是指可以稳定遗传的、易于识别的特殊的遗传多态性形式在经典遗传学中，指等位基因的变（差）异在现代遗传学中，指基因组中任何座位上的相对差异或者是DNA序列的差异5第一节 遗传标记 (Genetic marker)是指可以4一、遗传标记的作用在遗传学研究中，遗传标记作为染色体上的界标，主要应用于连锁分

2、析、染色体变异、基因定位、遗传作图及基因转移等在作物育种中，通常把与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用于对目标性状进行追踪选择、辅助选择以及基因型鉴定 6一、遗传标记的作用在遗传学研究中，遗传标记作为染色体上的界5二、理想的遗传标记应具备的条件多态性高表现共显性(只有共显性才能鉴定纯合和杂合基因型)对主要农艺性状影响小显现标记需要的经费少便于识别和记载7二、理想的遗传标记应具备的条件多态性高6形态标记(morphological markers) 细胞学标记(cytological markers) 生化标记(biochemical markers) 分子标记(molecular markers

3、) 三、遗传标记的发展8形态标记细胞学标记生化标记分子标记三、遗传标记的发展7指那些能够用肉眼明确观测的一类外观特征性状从广义上讲，形态标记还包括色素、生理特性、生殖（育性）特性、抗病虫性等有关的性状（一）形态标记Morphological Markers 9指那些能够用肉眼明确观测的一类外观特征性状（一）形态标记8优点：形态标记简单直观，经济方便，容易观察记载缺点：数量少，难以建立饱和的遗传图受环境影响大有些标记与发育不良性状连锁10优点：形态标记简单直观，经济方便，容易观察记载9（二）细胞学标记 Cytological Markers 能明确显示遗传多态性的细胞学特征染色体数目的变化和染色

4、体结构的变异11（二）细胞学标记 Cytological Marker10C-banding pattern of the amphiploid T. aestivum cv CS-Ae.speltoides accession #829(小麦)12C-banding pattern of the amp11缺点：鉴定困难，材料保存代价高标记数目有限难以开展精细定位13缺点：12主要包括贮藏蛋白、同工酶等标记（三）生化标记 Biochemical Markers 14主要包括贮藏蛋白、同工酶等标记（三）生化标记 Bioc13SDSseparates proteins by MW15SDSsep

5、arates proteins 14蛋白质电泳16蛋白质电泳15优点：基因表达的产物，可以直接反映基因产物的差异，受环境影响较小 缺点：标记数量有限，不能满足遗传和育种的需要每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术某些酶的活性具有发育和组织特异性17优点：16（四）分子标记 Molecular Marker概念：指在分子水平上可标识的遗传多态性 转换、颠换 插入/缺失 重排18（四）分子标记 Molecular Marker概念171、理想的分子标记应具有的特点高水平的多态性共显性遗传（可区分某一位点的纯合或杂合状态）在基因组中出现的频率高在基因组中均匀分布具有中性选择特征容易获得而且可快速分

6、析重复性好分离标记所需的费用低191、理想的分子标记应具有的特点高水平的多态性1820192、分子标记分析的关键技术基因组DNA酶切PCR电泳Southern blot序列测定单个碱基的差异显带结果判读212、分子标记分析的关键技术基因组DNA酶切PCR电泳So20聚丙烯酰胺凝胶电泳 分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间22聚丙烯酰胺凝胶电泳 分辨范围为1个碱基对到1000个碱基2123222423显带琼脂糖凝胶EB染色聚丙烯酰胺凝胶硝酸银染色带荧光分子的引物荧光捕获25显带琼脂糖凝胶EB染色24262527263、分子标记多态性的原理（1）酶切位点或引物结合位点的变化1 2个体1个体2

7、283、分子标记多态性的原理（1）酶切位点或引物结合位点的变27（2）酶切位点或引物结合位点之间的插入突变个体1个体21 229（2）酶切位点或引物结合位点之间的插入突变个体11 28（3）酶切位点或引物结合位点之间的缺失突变个体1个体21 230（3）酶切位点或引物结合位点之间的缺失突变个体11 29（4）酶切位点或引物结合位点之间的 重复序列的重复次数的变化个体1个体21 231（4）酶切位点或引物结合位点之间的个体11 230（5）单个核苷酸的突变ATGTCGTATCATCGATGTAGTATCATCG32（5）单个核苷酸的突变ATGTCGTATCATCGATG314、分子标记的分类基于

8、DNA-DNA杂交 RFLP基于PCRISSR, SSR, RAPD,SRAP基于PCR和RE酶切 AFLP基于单核苷酸多态性的分子标记 SNP应用最普遍的是RFLP、AFLP、SSR和SNP标记334、分子标记的分类基于DNA-DNA杂交 RFL32第二节 分子标记技术一、 基于分子杂交技术的分子标记Molecular Hybridization (核酸分子杂交)：不同来源的单链DNA与单链DNA间，在长于20bp的同源区域内，以氢键连接方式互补配对，形成稳定的双链结构的过程34第二节 分子标记技术一、 基于分子杂交技术的分子标记33基于DNA-DNA杂交（southern blotting

9、) 的标记RFLP:Restriction Fragment Length Polymorphism (限制性片段长度多态性标记）VNTR:Variable Number Tandem Repeats (minisatellites) （可变数目串联重复序列标记） 35基于DNA-DNA杂交（southern blottin34限制性片段长度多态性 (RFLP)36限制性片段长度多态性 (RFLP)353736RFLP是利用特定的限制性内切酶识别并切割（消化）不同生物个体的基因组DNA，由于不同个体等位基因之间碱基的互换、重排、缺失等变化导致限制性内切酶识别位点发生改变，从而造成基因型间限制性

10、片段长度的差异38RFLP是利用特定的限制性内切酶识别并切割（消化）不同37393840394140RFLP: single-locus probe（单位点探针）核DNA基因组文库cDNA文库细胞质DNA叶绿体和线粒体DNA文库特点位点特异性，共显性大多数是物种特异性的42RFLP: single-locus probe（单位41DNA探针标记可用放射性同位素3H，32P，33P非放射性物质生物素荧光染料43DNA探针标记可用42RFLP基本特点： 优点：共显性缺点：探针必须是单拷贝或寡拷贝的检测所需样本DNA量大(515ug)实验操作较繁琐，成本较高，探针制备较麻烦，检测中如要利用放射性同位

11、素，易造成环境污染，检测周期长可以用非放射性物质杂交信号相对较弱，灵敏度较同位素标记低且相对价格较高 44RFLP基本特点： 优点：共显性43二、基于PCR技术的分子标记短核苷酸序列引物耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）扩增目标DNA序列快捷、简易、灵敏等优点45二、基于PCR技术的分子标记短核苷酸序列引物44RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA （随机扩增多态性）SSR: Simple Sequence Repeats (Microsatellites) （简单序列重复）ISSR: Inter-simple sequence repeat （简单序列

12、重复间区）SCAR: Sequence Characterized Amplified Region （序列特征化扩增）STS: Sequence Tagged Sites （序列标签位点）46RAPD: Randomly Amplified Pol45（一）RAPD pronounced “rapid”1990年由Williams和Welsh提出的随机引物（arbitrary primer，810 bp），通过PCR扩增染色体组中的DNA，所获得长度不同的DNA片段凝胶电泳分离扩增片段，经染色来显示扩增片段的多态性47（一）RAPD pronounced “rapid”19464847S45

13、1对DH962冀棉5号F2群体的扩增图56:14 52.5:17.549S451对DH962冀棉5号F2群体的扩增图56:1448优点：技术简单，检测速度快RAPD分析所需DNA样品量少(一般510ng)，对DNA质量要求较RFLP低不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析成本较低缺点：显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子共迁移影响因素很多，稳定性和重复性差转化为SCAR及STS等表现为共显性标记50优点：49（二）序列特异扩增区域SCAR(Sequence Characterized Amplification Region) 将目标RAPD片段 (如与某目的基因连锁的R

14、APD片段)进行克隆并对其末端测序根据RAPD片段两端序列设计特定引物，通常为1824bp，一般引物前10个碱基应包括原来的RAPD扩增所用的引物对基因组DNA片段进行PCR特异扩增具有更高的重复性和稳定性；共显性遗传51（二）序列特异扩增区域SCAR(Sequence Ch50lanes 214低2-丙烯基, 低3-丁烯基bulk lanes 1524高2-丙烯基, 高3-丁烯基bulk52lanes 214低2-丙烯基, 低3-丁烯基bul515352（三）SSR(简单序列重复)又称微卫星DNA，它是一类由1-6个碱基组成的基序(motif)串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分

15、布于基因组的不同位置如(CA)n、(AT)n、(GC)n、(GATA)n等重复，n106054（三）SSR(简单序列重复)又称微卫星DNA，它是一类由5355541、SSR产生的分子生物学原理复制滑移561、SSR产生的分子生物学原理复制滑移55CACACACACACACACACACA不等交换（Unequal cross）CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACA对等交换不等交换CACACACACACACACACACA57CACACACACACACACACACA不等交换（Une56某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼

16、的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼两端互补序列人工设计合成引物，通过PCR反应扩增微卫星片段由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性 2、SSR分析技术原理58某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，57595860593、SSR的分析步骤获得SSR引物PCR扩增凝胶电泳显色利用已经存在的引物资源自己开发SSR引物613、SSR的分析步骤获得SSR引物利用已经存在的引物资源60GAGAGAGAGAGAGAGAGAGenomic DNA自主开发SSR引

17、物文库富集法 enriched libraryGAGAGAGAGAGAGAGAGA62GAGAGAGAGAGAGAGAGAGenomic DN61GAGAGAGAGAGAGAGAGA克隆到载体里Hybrid with poly GA/CT63GAGAGAGAGAGAGAGAGA克隆到载体里Hybr62选择阳性克隆、序列测定GAGAGAGAGAGAGAGAGA64选择阳性克隆、序列测定GAGAGAGAGAGAGAGAG63GGAAACAAAGTACTAGGTCCACCAAACTCTTCATTATGATACCTCATTAGTTGGATGAGGATAAATTATCTGATTTGCTGATTGGAAA

18、GCTATTTCATTGTTCTCGAAGTTTCTACACCCAACACCCATATCCGACACATTTTCGGACATGTGCATGGAGATACGACCTCCAAGGATCCTCCAAATATATGAAAATACGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAAAAGGTTGAACATACCCATACACTCACTCCCAAGTCCGAATAAGATAATTGGAAAGTGTAAGCAACCAAGTCCGAATAAGATAATTGGTAAGTGTCTGCTTCCTTTAGATGTATAACATTTTTCTATAGTGGTCAGCTCATCTATCTACTGCTTTATGCTGAAGGCAGG

19、GTAGGTACAGATCAAGCAAAATATTAGCCCCAGCTTATATATTGAACATTGAAGTATTTTCCAGTTATATGCATCTATTTCTTTGTATTTTTCTTCTTCGGTTATGCATTCTAACTGGA为何不能用AT/TA探针？65GGAAACAAAGTACTAGGTCCACCAAACT64ESTs通过基因的表达产物mRNA(信使RNA)反转录为cDNA随着植物EST计划的实施，公共数据库中的EST序列迅速增长 从EST中开发SSR66ESTs通过基因的表达产物mRNA(信使RNA)反转录为65NCBI网站公布的主要农作物的ESTs序列数67NCBI网站公布

20、的主要农作物的ESTs序列数66TTGCATTGCAGACCATTTTGTCTTCAAATATACATGACTTGAATAATGGAAACAAAGTACTAGGTCCACCAAACTCTTCATTATGATACCTCATTAGTTGGATGAGGATAAATTATCTGATTTGCTGATTGGAAAGCTATTTCATTGTTCTCGAAGTTTCTACACCCAACACCCATATCCGACACATTTTCGGACATGTGCATGGAGATACGACCTCCAAGGATCCTCCAAATATATGAAAATACATAATAATAATAATAATAAAAAAAGGTTGAACATACCCA

21、TACACTCACTCCCAAGTCCGAATAAGATAATTGGAAAGTGTAAGCAACCAAGTCCGAATAAGATAATTGGTAAGTGTCTGCTTCCTTTAGATGTATAACATTTTTCTATAGTGGTCAGCTCATCTATCTACTGCTTTATGCTGAAGGCAGGGTAGGTACAGATCAAGCAAAATATTAGCCCCAGCTTATATATTGAACATTGAAGTATTTTCCAGTTATATGCATCTATTTCTTTGTATTTTTCTTCTTCGGTTATGCATTCTAACTGGAAAAATGAACTCCAGGTTAGCATAAAGTAGA

22、CAATTCCCTTCACTTT68TTGCATTGCAGACCATTTTGTCTTCAAA676968研究基因组表达区内不同SSR模体的密度70研究基因组表达区内不同SSR模体的密度69 PCR扩增PCR反应组分：DNA模板一对引物dNTPTaq酶Mg 2+反应缓冲液ddH2O71 PCR扩增PCR反应组分：70 凝胶电泳72 凝胶电泳71 显色琼脂糖凝胶EB染色聚丙烯酰胺凝胶硝酸银染色带荧光分子的引物荧光捕获73 显色琼脂糖凝胶EB染色72CML60对DH962冀棉5号F2群体的扩增图BNL3655对DH962冀棉5号F2群体的扩增图74CML60对DH962冀棉5号F2群体的扩增图BNL

23、373BNL2921对DH962冀棉5号F2群体的扩增图75BNL2921对DH962冀棉5号F2群体的扩增图74SSR荧光标记76SSR荧光标记75SSR优点：一般检测到的是单一的复等位基因位点，提供的信息量高孟德尔方式遗传，呈共显性，可鉴别杂合子和纯合子所需DNA量少数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高可检测稀有重复基序通用性：SSR很保守，EST-SSR通用性强77SSR优点：76（四）ISSR用结合于两个相邻SSR区域内的引物去扩增它们中间的单拷贝序列78（四）ISSR用结合于两个相邻SSR区域内的引物去扩增它7779788079用2个核苷酸、3个核苷酸或4个核苷酸序列为基元(mo

24、tifs)，以其不同重复次数再加上几个非重复的锚定碱基组成随机引物如(AC)nX、(TG)nX、(ATG)nX、(CTC)nX、(GAA)nX等(X代表非重复的锚定碱基)(AC)nX：XC，T，GACACACACACACA ACACACACACACA81用2个核苷酸、3个核苷酸或4个核苷酸序列为基元(moti80828183828483858486858786ISSR特点开发费用降低可以在不同的物种间通用揭示的多态性较高精确度几乎可与RFLP相媲美检测非常方便88ISSR特点87（五）STS (序列标签位点)STS是对以特异引物序列进行PCR扩增的一类分子标记的统称STS引物的设计主要依据单拷

25、贝的RFLP探针(长度为200-500bp)，根据已知RFLP探针两端序列，设计合适的引物，进行PCR扩增RFLP-PCR 89（五）STS (序列标签位点)STS是对以特异引物序列进88优点：共显性遗传很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的比较，是沟通遗传图谱和物理图谱的中介特异序列的STS用来确定物理图谱及DNA片段排序在染色体上的位置缺点：STS标记的开发依赖于序列分析及引物合成，成本仍显太高90优点：89（六）序列相关扩增多态性Sequence-related Amplified Polymorphism, SRAP 上游引物长17bp，5端的前10 bp是一段填充序列，紧接着是CCG

26、G，组成核心序列及3端3个选择碱基，对外显子进行特异扩增下游引物长18bp，5端的前11 bp是一段填充序列，紧接着是AATT，组成核心序列及3端3个选择碱基，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增因不同个体、物种的内含子、启动子及间隔区长度不同而产生多态性具有简便、稳定、中等产率、便于克隆测序目标片段的特点91（六）序列相关扩增多态性Sequence-relate9092919392邯郸208Pima90及部分F2群体中的扩增图 94邯郸208Pima90及部分F2群体中的扩增图 93（七）Conserved ortholog sets95（七）Conserved ortholog sets9

27、4969597969897（八）intron polymorphism99（八）intron polymorphism9810099101100102101（九）Start Codon Targeted (SCoT) Polymorphism目标起始密码子多态性基因的起始密码子的附近序列是非常保守的，具有一致性SCoT标记的引物就是根据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼区域的保守性来设计。单引物可同时结合在双链DNA的正负链上的ATG翻译起始位点区域，从而扩增出两结合位点之间的序列。103（九）Start Codon Targeted (SC102104103Specific nucleoti

28、des in the primer sequence werefixed: the ATG codon (at positions +1, +2, and +3), G at position +4, C at position +5, and A, C, and C at positions +7, +8, and +9, respectively.105Specific nucleotides in the104106105107106三、基于PCR与限制性酶切技术结合的标记AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphisms（扩增片段长度多态性）CA

29、PS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequences（扩增片段限制性酶切长度多态性）108三、基于PCR与限制性酶切技术结合的标记AFLP: 107（一）AFLP: 扩增片段长度多态性1992年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法具有重要的实用价值，一出现就被Key gene公司以专利形式买下较其它分子标记有着明显的优越性，因此迅速传播开来，尽管它已受到了专利保护，但世界上很多实验室都在努力探索在自己的研究中应用AFLP技术Zabeau和Vos不得不将其专利解密，并以论文形式正式发表出来109（一）AFLP: 扩增片段长度多态

30、性1992年由荷兰科1081101091111101121111、限制性内切酶酶切用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统中对基因组DNA进行酶切，一种为低频剪切酶(识别位点为六碱基的rare cutter) ，另一种为高频剪切酶(识别位点为四碱基的frequent cutter) 利用双酶切可产生更好的扩增反应，在凝胶上产生适宜大小的适于分离的片段，不同的内切酶组合及选择性碱基的数目和种类可灵活调整片段的数目，从而产生不同的AFLP指纹1131、限制性内切酶酶切用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统112EcoRI为六碱基识别位点的低频剪切酶，其他限制性酶如HindIII、PstI、SacI、ApaI

31、 在AFLP中和EcoRI作用相同，但EcoRI更为常用MseI为四碱基识别位点的高频剪切酶，MseI常用于富含AT的真核生物基因组DNA链的切割；同为四碱基识别位点的TaqI酶会产生扩增片段的不等分布，常出现在凝胶的上部；MseI会产生更小的限制性片段，在AFLP指纹分析中更为常用AFLP分析中常用的酶组合为EcoRI/MseI114EcoRI为六碱基识别位点的低频剪切酶，其他限制性酶如113理论上，应该得到3种酶切片段，且MseI-MseI片段较MseI-EcoRI片段多但事实上在AFLP反应中，MseI-EcoRI片段扩增较MseI-MseI片段优先原因可能是MseI引物较EcoRI引物

32、的融合温度低，使得在该反应条件下MseI- MseI片段的扩增比MseI-EcoRI片段困难MseI-MseI片段由同一引物扩增，末端出现反向重复序列，当引物融合时，末端碱基配对形成茎环结构，影响继续扩增115理论上，应该得到3种酶切片段，且MseI-MseI片段1142、AFLP接头是一种人工合成的双链DNA, 一般长度是1418个核苷酸, 由核心顺序和内切酶位点特异顺序两部分组成 3、AFLP引物是一种人工合成的单链寡核苷酸，一般长度为18-20个核苷酸，由核心顺序 (core)、内切酶位点特异顺序 (ENZ)和选择性核苷酸顺序(EXT)三部分组成AFLP引物除了含有能与接头及酶切位点相互

33、补的序列外，其3末端还填加有1-3个选择性核苷酸顺序1162、AFLP接头115CTC GTA GAC TGC GTA CC CTG ACG CAT GGT TAA EcoRI adapter GAC GAT GAG TCC TGA G TA CTC AGG ACT CATMseI adapter 117CTC GTA GAC TGC GTA CC CTG 116EcoRI GACTGCGTACC AATTC NNN MseI GATGAGTCCTGAG TAA NNN CORE ENZ EXT 引物的核心序列118EcoRI GACTGCGTACC AATTC N117酶切片段要经过连续2次

34、PCR扩增，通过这样两步扩增反应使产生的扩增结果更清楚、重复性更好第1次PCR 扩增被称为预扩增反应(Pre-amplification)，所用的AFLP引物只含有1个选择性核苷酸，选择扩增性能较差，因此大量的扩增产物在凝胶中往往形成连续的一片预扩增反应条件与常规PCR反应条件大致相同119酶切片段要经过连续2次PCR扩增，通过这样两步扩增反应118选择性扩增的反应条件与普通PCR有所不同，主要不同之处是复性温度，它是采用温度梯度PCR其PCR开始于高温复性(一般采用65，比常规PCR 反应的复性温度高10) 以期获得最佳选择性以后复性温度逐步降低，一直降到复性效果最好的温度(一般是56)，然

35、后保持在这个温度下复性，完成其余的PCR循环周期120选择性扩增的反应条件与普通PCR有所不同，主要不同之处1191211204、扩增产物的凝胶电泳分析选择性扩增产物一般在5%6%的变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE序列分析胶)上经过电泳分离，形成DNA指纹，凝胶经过干燥、放射性自显影后即可进行结果分析1224、扩增产物的凝胶电泳分析选择性扩增产物一般在5%6121放射自显影银染 TAG106：1068-1074123放射自显影银染 TAG1221241231251246、AFLP特点优点：信息量大缺点：要求质量高的DNA操作繁琐，条件优化较难染色体聚集1266、AFLP特点125（二）CAPS (

36、酶切扩增多态性序列)1、基本原理：利用已知位点的DNA序列资源（基因数据库、基因组或cDNA克隆以及克隆的RAPD条带等）设计一套特异的PCR引物(19-27bp) 扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色127（二）CAPS (酶切扩增多态性序列)1、基本原理：1261281271291282、优点：引物与限制酶组合非常多，增加了揭示多态性的机会，而且操作简便，可用琼脂糖电泳分析在真核生物中，CAPS标记呈共显性，即可区分纯合基因型和杂合基因型所需DNA量极少结果稳定可靠操作简便、快捷、自动化程度高 1302、优点：129单核苷

37、酸多态性（SNP: Single nucleotide polymorphism）指由于基因组的某个位点上单个核苷酸的变异而产生的差异。DNA分子单个核苷酸的变异有碱基替换、插入和缺失等形式, 而SNPs不包括碱基的插入与缺失四、基于DNA芯片技术的分子标记 131单核苷酸多态性（SNP: Single nucleo130132131两个序列：可指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异遗传群体：在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的核苷酸且其出现频率大于1% 133两个序列：可指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差132134133An SNP Caused Loss of Seed

38、 Shattering During Rice Domestication135An SNP Caused Loss of Seed 134（一）SNPs基本特性 1、双等位型标记(dialleleic markers) ：理论上, 单碱基替换包括1 个转换CT (GA) 和3 个颠换CA (GT)、CG (GC)、AT (TA) 等四种不同的类型频率各不相等, 其中转换和颠换之比为21, 而且第三、第四种类型很少, 几乎无法检出136（一）SNPs基本特性 1、双等位型标记(dialle1352、在DNA 分子上分布不均匀多在CpG位点上发生CT的转换, 约占总SNPs的25%，大多数的C是

39、甲基化的, 它能够自发脱氨基产生T在转录序列中SNPs 的频率低于非转录序列中SNPs 的频率, 而且转录区的SNPs非同义突变的频率比其它突变类型的频率要低得多3、 有很高的密度拟南芥中有37344个SNP，密度上达到了基因组“多态位点”数目的极限1372、在DNA 分子上分布不均匀1364、具有遗传稳定性基于单核苷酸的突变，突变率为10-9，与微卫星等重复序列多态性相比，具有更高的遗传稳定性5、SNPs 的检测和分析易实现自动化双等位型，只需+/-分析就可以确定，有利于发展自动化技术进行大规模的筛选或检测1384、具有遗传稳定性137（二）常用SNP分型技术酶切PCR-SSCP直接PCR检

40、测HRMDNA芯片139（二）常用SNP分型技术酶切1381、酶切1401、酶切1392、PCR-SSCP单链构象多态性（single-strand composition polymorphism, SSCP）基本原理：单链DNA在凝胶中的迁移率除了与其长短有关外,更主要的是取决于DNA单链间所形成的构象非变性条件下,DNA单链内部可以折叠形成具有一定空间结构的构象,这种构象由DNA单链的碱基排列顺序所决定即便是相同长度的DNA单链都会因其碱基顺序不同,甚至单个碱基的改变造成单链空间构象产生变化,引起单链在凝胶中电泳迁移率的差异,从而表现出多态性1412、PCR-SSCP单链构象多态性（si

41、ngle-st1401421413、直接PCR检测通用引物扩增包含SNP区域特异引物只能与其中的一种碱基互补含错配碱基的序列只有一个产物否则有2个扩增产物1433、直接PCR检测通用引物扩增包含SNP区域1421441434、HRMhigh resolution melting curveHRM技术主要是基于核酸分子物理性质的不同不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置HRM技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分1454、HRMhigh resolution meltin144PCR的扩增子进行加热，温度从

42、50C逐渐上升到95C。在此过程中，扩增子逐渐解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA链完全分开LCGreen是饱和的荧光染料，在进行HRM分析时，饱和染料占据了DNA双链上每一对碱基上的空位;在双链解链时，染料立即与双链脱离，使得荧光信号发生较大的变化146PCR的扩增子进行加热，温度从50C逐渐上升到951451471465、DNA芯片1485、DNA芯片147149148150149151150五、分子标记发展趋势由“anonymous marker” 向“functional marker”发展Gel-based 向chip-based and genotype by sequencin

43、g发展152五、分子标记发展趋势由“anonymous marke151153152154153155154六、如何选择分子标记研究对象的相关信息研究目的结果的可靠性和可重复性分子标记的遗传特性费用时间156六、如何选择分子标记研究对象的相关信息155第三节、遗传连锁图 genetic linkage map基因组内基因在染色体上线性排列图以及多态性DNA标记相对位置的图谱形态标记、细胞学标记、生化标记、分子标记植物基因组有四种图谱：遗传连锁图、物理图、核苷酸序列图和基因图 157第三节、遗传连锁图 genetic linkage 156一、遗传连锁图构建的基础 构建遗传图谱的依据是同源染色体

44、减数分裂过程中会发生交换，交换的结果便使染色体上的基因发生重组两个基因之间发生重组的频率取决于它们之间的相对距离基因间的遗传距离用重组率表示，1cM1的重组率 158一、遗传连锁图构建的基础 构建遗传图谱的依据是同源染色157159158160159二、基因间的遗传图距(交换值)161二、基因间的遗传图距(交换值)160Independent assortment of unlinked genes162Independent assortment of u161163162(1-r)/2 AB(1-r)/2 abr/2 Abr/2aBab(1-r)/2 AaBb(1-r)/2 aabbr/2

45、 Aabbr/2 aaBb164(1-r)/2 AB(1-r)/2 abr/2 A163例: 测交 AaBb x aabbAaBbAabbaaBbaabbTotal观察值1403832150360预期值90909090360总 X2 = (O-E)2 E= (140-90)2 + (38-90)2 + (32-90)2 + (150-90)2 = 135.1990909090自由度为3，远远大于 X32 (7.81)165例: 测交 AaBb x aabbAaBbAabbaa164此RFLP标记是否与紫色种皮基因连锁？遗传距离是多少？0.5/1055 cM166此RFLP标记是否与紫色种皮基因

46、连锁？0.5/105165三点测交（three-point test cross）167三点测交（three-point test cross166168167 ab= 18.5 a c b c6.513.2 19.7 abRILBC1和DH 201群体大小与作图精度的关系 200六、分子标记（图谱）与作物改良品种鉴定品种保护育种的亲本选择种质资源的保存和利用基因（QTL）定位图位克隆基因分子标记辅助选择202六、分子标记（图谱）与作物改良品种鉴定201玉米不同品种聚类203玉米不同品种聚类202204203QTLeQTLpQTL基因定位205QTLeQTLpQTL基因定位204第四节 质量性

47、状基因的定位最好的标记是基因本身紧密连锁的标记206第四节 质量性状基因的定位最好的标记是基因本身205（一）质量基因的定位 近等基因系分析法分离集团混合分析法 1. 基于性状表现型的BSA法2. 基于标记基因型的BSA法 3. 极端集团-隐性群法207（一）质量基因的定位 近等基因系分析法2061、近等基因系分析法两个或多个形态上相似，遗传背景相同或相近，只在个别染色体区段上存在差异的遗传材料，称近等基因系(Near isogenic lines，NIL)2081、近等基因系分析法两个或多个形态上相似，遗传背景相207番茄种质资源利用209番茄种质资源利用208分子标记辅助回交育种供体受体F

48、1BC1BC2210分子标记辅助回交育种供体F1BC1BC2209分子标记辅助回交育种211分子标记辅助回交育种210在回交第N代，轮回亲本基因组所占比例为1-(12)nm。目标基因m越多，则轮回亲本基因组恢复得越慢供体亲本的目标性状基因与其附近的其他基因存在连锁时，轮回亲本置换供体亲本基因的进程将要减缓，其减缓程度依连锁的紧密程度而异连锁累赘（linkage drag）：由于基因连锁的结果，在回交导入目标基因的同时，与目标基因连锁的染色体片段将随之进入回交后代中保证含有供体目标基因，尽量选择形态上与轮回亲本接近的植株分子标记辅助选择212在回交第N代，轮回亲本基因组所占比例为1-(12)21

49、12132122、分离集团混合分析法bulked segregation analysis，BSA （1）基于性状表现型的BSA法在作图群体中，依据目标性状表型的相对差异，将个体或株系分成两组，DNA混合，形成相对的DNA池除了在目标基因座所在的染色体区域的DNA组成上存在差异之外，来自基因组其他部分的DNA组成是完全相同的两个DNA池间表现出多态性的DNA标记，就有可能与目标基因连锁获得连锁标记后，再回到群体上根据分离比例进行验证，同时也可估算出标记与目标基因间的图距2142、分离集团混合分析法bulked segregat213215214（2）基于标记基因型的BSA法 根据目标基因两侧的

50、分子标记的基因型对分离群体进行分组混合 216（2）基于标记基因型的BSA法 根据目标基因两侧的分215（3)极端集团-隐性群法基本原理是： 利用极端集团鉴别目标基因所在染色体区段 用表现型为隐性的极端个体（隐性群）确定基因位点在分子标记连锁图上的准确位置217（3)极端集团-隐性群法基本原理是：216218217分离集团混合分析法 219分离集团混合分析法 218重组值：c = ( N1 + N2 / 2 ) / N 220重组值：c = ( N1 + N2 / 2 ) / N219第五节 数量性状基因的定位Quantitative character连续变异数量性状受微效多基因控制(Qua

51、ntitative trait loci, QTL)对外界环境变化比较敏感需要统计分析221第五节 数量性状基因的定位Quantitative 220一、如何定位QTL？定位QTL所需的信息数量性状的度量值全基因组的分子标记数据两步分析遗传连锁图构建分子标记与数量性状之间的统计分析：QTL的个数、位置、效应及互作222一、如何定位QTL？定位QTL所需的信息221二、QTL作图方法确定数量性状位点基因与分子标记间的连锁关系 单标记分析法、区间定位法和复合区间定位法计算机程序包Mapmaker/QTL， Map Manager， QTLmapper，QTLcartographer等 223二、Q

52、TL作图方法确定数量性状位点基因与分子标记间的连222（一）单标记分析如果某个标记与某个(些)QTL连锁，那么在杂交后代中，该标记与QTL间就会发生一定程度的共分离，该标记的不同基因型在(数量)性状的分布、均值和方差上将存在差异检验这些差异就能推知该标记是否与QTL连锁224（一）单标记分析如果某个标记与某个(些)QTL连锁，那223简单直观不能估计QTL的具体位置和效应，仅用于对数据的初步分析225简单直观224（二）区间定位法利用染色体上一个QTL两侧的一对标记，建立个体数量性状测量值对双侧标记基因型指示变量的线性回归关系回归关系显著，则表明该QTL存在，并能估计出该QTL的位置和效应极大

53、似然函数估计两标记间存在QTL的可能性和效应大小回归模型的适合性检验通常采用似然比检验法，即存在QTL的概率对不存在QTL的概率之比（其对数为LOD值）226（二）区间定位法利用染色体上一个QTL两侧的一对标记，225227226228227229228QTL作图原理MMMmmmMMMmmm性状平均值分别表示QQ, Qq 和 qq 的频率无连锁有连锁F值,LR 或 LOD曲线原假设 H0: 无QTLs 备择假设H1: 有QTLs230QTL作图原理MMMmmmMMMmmm性状平均值分别表229231230比单标记分析法更加准确和有效当一条染色体上同时存在一个以上的QTL时，无法排除被检区间之外

54、的QTL对被检区间的影响+ + + 232比单标记分析法更加准确和有效+ 231（三）复合区间定位法（composite interval mapping，CIM）利用多元回归的特性，构建了不受区间以外的其它QTL影响的检验统计量，以此统计量进行区间检验，可将同一染色体上的多个连锁QTL的效应区分开来提高了QTL定位的准确度233（三）复合区间定位法（composite inter232（四）基于混合线性模型的复合区间作图（MCIM） Zhu, 1998,1999 234（四）基于混合线性模型的复合区间作图（MCIM） 233第十三章 分子标记辅助育种Marker-assisted breed

55、ing235第十三章 分子标记辅助育种Marker-assist234本章重难点分子标记辅助选择的原理分子标记辅助选择的优势分子标记辅助选择的限制因素外源基因的转移与基因聚合236本章重难点分子标记辅助选择的原理235第一节 分子标记辅助选择利用易于鉴定的遗传标记来辅助选择来提高选择效率和降低育种盲目性常规育种过程中基本上应用形态学标记，把与目标基因连锁的、易于识别的性状作为标记，对目标性状进行相关选择大麦中抗秆锈病的基因与抗散黑穗病的基因紧密连锁水稻中紫叶标记基因与恢复基因共分离对质量性状一般是有效的主效基因与数量性状连锁的辅助选择数量性状策略237第一节 分子标记辅助选择利用易于鉴定的遗传

56、标记来辅助选236形态标记辅助选择的缺点数量有限 一些形态标记常与不良性状连锁 多基因控制的重要农艺性状受到环境影响较大 表型测量难度较大或误差较大 特定的表现时期 效率较低 238形态标记辅助选择的缺点数量有限 237ABQmarkerputative genemarkerrr为A 与 Q 之间的重组率一、分子标记辅助选择的遗传基础 1、前景选择 (foreground selection) 239ABQmarkerputative genemarke238Conditional Probability(1-r)/2 AQr/2 Aqr/2 aQ(1-r)/2aq(1-r)/2 AQ(1-r

57、)2/4r(1-r)/4r(1-r)/4(1-r)2/4r/2 Aqr(1-r)/4r2/4r2/4r(1-r)/4r/2 aQr(1-r)/4r2/4r2/4r(1-r)/4(1-r)/2 aq(1-r)2/4r(1-r)/4r(1-r)/4(1-r)2/4240Conditional Probability(1-r239QQQqqqAA(1-r)2/4r(1-r)/4 + r(1-r)/4r2/41/4Aar(1-r)/4 + r(1-r)/4(1-r)2/4 + r2/4 + r2/4 + (1-r)2/4r(1-r)/4 + r(1-r)/41/2aar2/4r(1-r)/4 + r(1-r)/4(1-r)2/41/41/41/21/41.0Prob.(QQ/AA) = Prob(QQ and AA) = (1-r)2/4 = (1-r)2Prob.(QQ/AA) = Prob(AA) 1/4241QQQqqqAA(1-r)2/4r(1-r)/4 + 240Marker Assisted Selection (MAS)MarkerP(Qj/Mi)QQQqqqAA(1-r)22r(1-r)r2Aar(1-r)(1-r)2+r2r(1-r)aar22r(1-r)(1-r)2242Ma