大肠杆菌感受态细胞制备

1、大肠杆菌感受态细胞制备第1页，共13页，2022年，5月20日，15点9分，星期二一、实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备的方法和技术。第2页，共13页，2022年，5月20日，15点9分，星期二二、实验原理感受态细胞制备:所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统（Restriction-Modification）缺陷的变异株，以防止对导入的外源DNA的切割，用符号R-M-表示。第3页，共13页，2022年，5月20日，15点9分，星期二二

2、、实验原理其基本原理是：细菌处于0的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经过42短时间的热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。第4页，共13页，2022年，5月20日，15点9分，星期二 三、实验材料与设备1、用品与与仪器： 超净工作台、恒温培养箱、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、冰箱、制冰机等；1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒。 镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒

3、精灯、无菌牙签、 吸水纸，一次性塑料手套等；E.coli DH5受体菌(R-M-)， pGEX-4T-2质粒(Ampr)。第5页，共13页，2022年，5月20日，15点9分，星期二三、实验材料与设备2、试剂：LB培养基:蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L， NaCl 10g/L，琼脂粉 15g/L（固体培养基），用10 mol/L的NaOH调节pH为7.0，高压灭菌；氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mgmL；含有抗菌素的LB平板培养基：将配置好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却到60度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为50gmL浓度50-100gmL）；第6页，共13页，2022年，5月2

4、0日，15点9分，星期二超净工作台第7页，共13页，2022年，5月20日，15点9分，星期二恒温培养箱第8页，共13页，2022年，5月20日，15点9分，星期二制冰机第9页，共13页，2022年，5月20日，15点9分，星期二高速冷冻离心机和超速离心机等第10页，共13页，2022年，5月20日，15点9分，星期二四、实验操作1、从新活化的E.coli DH5平板上挑取一单菌落，接种于35ml LB液体培养中，37振荡培养至对数生长期(12h左右)； 2、将该菌悬液以1:1001:50转接于100ml LB液体培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次OD

5、600，至OD600为0.30.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中； 3、培养物于冰上放置20min； 4、 04，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；第11页，共13页，2022年，5月20日，15点9分，星期二四、实验操作 5、04， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min； 6、 04， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 L冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4放置1224h，其转化效率可以增高46倍；也可加入占总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70条件下，可保存半年至一年。第1