基因工程复习资料

1、第一章基因工程概述一、名词解释基因、基因操作、基因工程、重组DNA技术基因：是编码产生蛋白质或RNA等具有特定功能产物的一段具有遗传效应的DNA片段，是控制生物性状的基本遗传单位。基因操作：是指对基因进行分离、分析、改造、重组、转移、检测和表达等操作的简称。基因工程：专指为实践应用而进行的基因重组事件，具体是指通过基因操作来定向改变或修饰生物体，并具有明确应用目的的活动。重组DNA技术：又称基因工程。二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。（1）获得目的基因（2）目的基因与克隆载体连接，形成重组子（3）将重组子转化受体细胞，获得转化子（4）转化子检测和筛选（5）目的基因在受体中被表达，获得所

2、需的遗传性状或产物2、简述基因工程操作的理论依据。（1）基因具有相同的物质基础（2）基因是可切割和粘合的（3）基因是可转移的（4）多肽与基因之间有对应关系（5）遗传密码通用（6）基因可以复制遗传3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。理论三大发现：遗传物质是DNA（基因） DNA的双螺旋结构和半保留复制 中心法则和氨基酸技术三大发明：限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶、同裂酶、同尾酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶限制性内切酶：是一类能识别双链DNA分子内部某种特殊的核苷酸序列，并使每个核酸链上特定部位相邻的两个核苷

3、酸之间的磷酸二酯键断开的一类核酸内切酶。同裂酶：指来源不同，但识别相同靶序列，切割产生不同或相同末端的限制性内切酶。即不同来源的限制性内切酶可切割相同的序列。同尾酶：指来源各异，识别靶序列各不相同，但切割产生相同末端的限制性内切酶。同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。DNA连接酶：催化DNA片段两侧（相邻）核苷酸的3羟基和5磷酸基之间形成磷酸二酯键，使断开的DNA连接起来的酶。DNA聚合酶：催化DNA合成的酶逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。第一个字母：取宿主属名首字母，大写斜体。第二、三个字母：取宿主种名前两个字母，小写斜体第四个字母：为宿

4、主的株号，正体第五个字母：发现顺序号，大写罗马字体，正体2、影响限制性内切酶活性的因素主要有哪些？（1）DNA样品的纯度（2）DNA样品的甲基化程度（3）DNA的分子结构（4）反应缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端ph值等（5）酶切反应的温度与时间3、影响连接反应效率的因素主要有哪些？（1）DNA的浓度（2）反应温度与时长（3）ATP浓度（4）连接酶浓度4、大肠杆菌DNA聚合酶有哪些活性？分别简要说明其主要用途。53聚合酶活性：合成双链DNA或c DNA的第二链，补平5突出端53外切酶活性：形成3突出端，切平5突出端，降解RNA35外切酶活性：形成5突出端，切平3突出端，降

5、解单链DNA5、简述切口平移法标记DNA的原理。答：首先，在Mg2+存在下利用低限量的DNase I处理双链DNA，随机产生少量切口；然后，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53外切酶活性在切口处向3端平移去除核苷酸，同时，其53聚合酶活性则将切口作为引物沿53方向催化DNA合成；随着反应的进行，5端核苷酸不断去除，3端核苷酸不断掺入，导致切口沿着DNA合成方向移动，即切口平移。如果在反应体系中加入标记dNTP，则这些标记dNTP将取代原有的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子。6、简述交换（置换）法标记DNA的原理。答：反应体系中只有一种标记的dNTP存在时，可利用大肠杆菌DNA聚合酶I或T4/T7

6、 DNA聚合酶的35外切酶活性从3端降解DNA，当露出与该标记dNTP互补的碱基时，上述酶的53聚合酶活性则催化该位置发生合成反应，用标记的dNTP置换原来的核苷酸残基，产生3端标记的DNA。第三章基因工程的载体一、名词解释载体、质粒、噬菌体、噬菌体溶菌周期、噬菌体溶原周期、克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体、表达标签载体：在基因工程操作中，能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子质粒：独立于染色体外的能够自主复制的双链共价闭合环状DNA分子噬菌体：是感染细菌，真菌，藻类，放线菌，螺旋菌等微生物的病毒的总称噬菌体溶菌周期：感染宿主细胞后，立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗

7、粒，并导致宿主细胞裂解，释放出大量子代噬菌体。噬菌体溶源周期：感染宿主细胞后，将自己的DNA整合到宿主的基因组中，与宿主染色体一起复制，并随宿主细胞的分裂而传递给子代。克隆载体：具有复制区（包含复制起点），多克隆位点和选择标记等基本元件，用于扩增和保存DNA片段的载体。表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加按表达元件（如启动子，核糖体结合位点，终止子等），用于表达目的基因的载体。穿梭载体：能够在两类不同的宿主中复制，增殖和选择的载体。整合载体：将某个基因或某些基因插入到宿主的染色体中的载体。表达标签：用作分离的载体蛋白。二、思考题1、简述克隆载体具备的基本条件。（1）具有复制区（含复制起点）

8、，在宿主细胞内能够自主复制（ori）（2）具有多克隆位点，便于插入外源DNA（MCS）（3）具有选择标记，便于筛选（4）分子量小，拷贝数多（5）易从宿主细胞中分离纯化2、以大肠杆菌为例，解释利用互补筛选重组质粒的原理。答：在IPTG的诱导作用下，lacZ基因编码产生-半乳糖苷酶，可以分解Xgal产生蓝色的产物。当大肠杆菌宿主细胞中仅携带一个lacZ M15基因，编码产生无活性的-半乳糖苷酶C端肽段，而质粒载体上含有一个lacZ基因，编码产生无活性的-半乳糖苷酶N端肽段（即-肽）时，两者可以在细胞内结合形成有活性的-半乳糖苷酶，从而在含有X-gal和IPTG的培养基上形成蓝色菌斑，称为-互补作用

9、。而当把外源DNA片段插入到质粒载体的lacZ基因中获得的重组载体导入大肠杆菌细胞，会导致-互补功能丧失，从而在含有X-gal和IPTG的培养基上形成白色菌斑。3、解释TA克隆的基本原理。大部分DNA聚合酶进行PCR反应时会在PCR产物双链DNA每条链的3末端添加一个“A”碱基，根据这一特点，人为的在线性化平末端质粒载体每条链的3末端添加一个“T”碱基，使它们之间可以碱基互补配对，在DNA连接酶的催化下，连接形成含有目的基因的重组DNA分子，即TA克隆。4、简述利用质粒载体进行基因克隆的基本步骤。（1）目的基因克隆（设计引物PCR）（2）质粒载体提取（摇菌提取质粒）（3）目的基因和质粒载体酶切

10、（选择内切酶酶切）（4）目的基因和质粒载体连接（5）连接片段转化受体细胞（制备感受态细胞转化培养）（6）阳性单克隆菌筛选（挑菌PCR检测送测序）5、简单描述噬菌体的溶原状态和裂解生长，及其在构建载体中的作用。答：噬菌体溶原周期是指感染宿主细胞后，将自己的DNA整合到宿主的基因组中，与宿主染色体一起复制，并随宿主细胞的分裂而传递给子代。利用噬菌体DNA定点整合到宿主基因组DNA上的重组原理建立Gateway重组技术用于载体的构建。噬菌体溶菌周期是指感染宿主细胞后，立即在菌体内复制，并合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致宿主细胞解体，释放出大量子代噬菌体。利用噬菌体作为载体，在构建载体时，

11、外源DNA片段可插入或替换控制溶原状态的基因区段。6、简述利用噬菌体载体进行基因克隆的基本步骤。（1）目的基因克隆（外源DNA片段）（2）噬菌体载体的提取（3）外源DNA片段与载体的酶切（4）外源DNA片段与载体的连接（5）重组噬菌体载体的体外包装（6）包装噬菌体感染受体细胞（7）阳性重组子筛选7、以大肠杆菌为例，说明表达载体比克隆载体多了哪些功能元件？各有什么生物学功能？答：表达载体是在克隆载体基本骨架的基础上增加了启动子、核糖体结合位点和终止子等表达元件。启动子：DNA上与RNA聚合酶结合的一段序列，启动RNA转录，包含转录起始位点。核糖体结合位点：转录生成的mRNA上与核糖体结合的位点，

12、启动蛋白质翻译。终止子：提供转录终止信号的DNA序列，终止转录。8、什么是表达标签，有何作用？列举2类用作表达标签的蛋白。答：表达标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或蛋白，用于目的蛋白的表达、检测、示踪、分离和纯化等。例如，纯化标签（GST、HIS、FLAG）、报告标签（GUS、GFP、RFP）、定位标签（信号肽、核定位信号）。第四章核酸操作的基本技术一、名词解释琼脂糖凝胶电泳：是以琼脂糖为介质，带电颗粒在电场的作用下，向与其电荷相反的电极水平移动聚丙烯酰胺凝胶电泳：是以聚丙烯酰胺为介质，带电颗粒在电场作用下，向与其电荷相反的电极垂直移动。Southern杂交;D

13、NA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象是DNA，探针为DNA。Nouthern杂交：将琼脂糖凝胶上的RNA转移到硝酸纤维膜上从而能够与互补二、思考题1、简述CTAB法提取DNA的原理。答：CTAB是一种阳离子去垢剂，可以溶解细胞膜，使DNA释放出来，并形成溶于高盐溶液的CTAB-核酸复合物。通过有机溶剂（酚/氯仿/异戊醇）抽提，去除蛋白质、脂类、酚类等杂质。然后加入乙醇或异丙醇破坏DNA的水化层，使DNA失水而聚合沉淀。最后用75%的乙醇洗涤DNA沉淀，去除盐等杂质。实验中利用EDTA螯合Mg2+来抑制DNase对DNA的降解作用。2、简述SDS法

14、提取DNA的原理。答：SDS是一种阴离子去垢剂，可以溶解细胞膜，使DNA释放出来，还可以变性蛋白质，并形成溶于有机溶剂的SDS-蛋白质复合物。DNA溶于水，通过有机溶剂（酚/氯仿/异戊醇）抽提，可以去除蛋白质、脂类、酚类等杂质。然后加入乙醇或异丙醇破坏DNA的水化层，使DNA失水而聚合沉淀。最后用75%的乙醇洗涤DNA沉淀，去除盐等杂质。实验中利用EDTA螯合Mg2+来抑制DNase对DNA的降解作用。3、简述碱裂解法提取质粒DNA的原理。答：质粒是独立于染色体外的、能够自主复制且稳定遗传的遗传因子，是一种共价闭合环状的双链DNA分子。强碱性条件下，质粒DNA双链间的氢键断裂，双螺旋结构解开而

15、变性，但两条环状的互补链不完全分离；当酸中和至中性时，质粒DNA迅速准确配对重新恢复原来构型，溶于水中。强碱性条件下，染色体DNA双链间的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，两条线性互补链完全分离；当酸中和至中性时，染色体DNA不能复性，而与破裂的细胞壁，蛋白质相互缠连成不溶物，经离心除去。4、简述琼脂糖凝胶电泳中DNA迁移的原理。答：迁移方向电荷效应：DNA分子是两性电解质，在碱性（pH8.0）缓冲液中，磷酸基团解离，带负电荷，向正极移动。迁移速率分子筛效应：DNA分子迁移速率同其与凝胶介质间的摩擦系数呈反比，同一介质中，摩擦系数主要与DNA分子的大小和构型相关。5、比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰

16、胺凝胶电泳用途的异同。答：琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶电泳分辨率低，分辨DNA片段大小为100-50000bp，聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，分辨DNA片段大小为1-1000bp。琼脂糖凝胶电泳采用水平装置在强度和方向恒定的电场下进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置在强度和方向恒定的电场下进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳操作比琼脂糖的困难。6、简述紫外分光光度法检测核酸浓度和纯度的原理。答：核酸在紫外线260nm波长处有最大吸收峰，蛋白质在280nm波长处有最大吸收峰，盐和其它杂质的吸收峰则聚集在230nm波长处，通过A260/A280和A260/A230的比

17、值可以判定出核酸的纯度。1OD260分别对应50g/mL的dsDNA，33g/mL的ssDNA，40g/mL的ssRNA含量，通过260nm处的吸光值可以推定处核酸的浓度。7、简述Trizol法提取RNA的原理。答：Trizol试剂是一种直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，其主要成分为异硫氰酸胍和酸性苯酚。其中异硫氰酸胍可以裂解细胞，解离核糖体，而苯酚可以变性蛋白质，从而使核酸与蛋白质分离，酸性条件下，DNA在酚相，RNA在水相，两者就分开了。然后加入氯仿抽提，可以去除蛋白质、脂类、酚类等杂质，离心后，样品分为水样层和有机层，其中RNA在水相中，蛋白

18、质和DNA留在有机相中。收集水样层，加入异丙醇破坏RNA的水化膜，使RNA失水而聚合沉淀。最后用75%的乙醇洗涤RNA沉淀，去除盐、多糖等杂质。8、印记分子杂交主要有哪些类型，并分别说明其用途。答：Southern杂交：检测DNANorthern杂交：检测RNAWestern杂交：检测蛋白质菌落杂交或噬菌斑杂交：检测阳性克隆基因芯片：检测mRNA的含量和结构，重测序，SNP检测。第五章目的基因的获取一、名词解释目的基因:准备要分离，改造，扩增或表达的基因。基因组DNA文库:是指将某种生物的整个基因组DNA进行酶切片段化，然后与特定载体连接，转入受体细胞产生的克隆载体，包含全基因组DNA上的所有

19、编码区与非编码区序列。cDNA文库:是指将某种生物的总mRNA反转录成cDNA，然后与特定载体连接，转入受体细胞产生的克隆载体。聚合酶链反应（PCR）：是一种体外模拟体内DNA复制的方式，可以选择性的扩增DNA某个区域的序列。Tm值：是指溶液中有半数的DNA分子解链为单链时的温度。二、思考题1、简述基因组DNA文库构建的基本步骤。（1）载体的选择和制备（2）基因组DNA的提取（3）DNA片段的制备（酶切）（4）载体与DNA片段的连接（5）重组DNA分子转化或侵染宿主细胞（6）重组克隆的筛选和保存2、简述cDNA文库构建的基本步骤。（1）载体的选择与制备（2）细胞总RNA的提取（3）mRNA的分

20、离（4）双链cDNA的合成（5）双链cDNA与载体的连接（直接平末端或添加带有限制性切酶位点接头后酶切连接）（6）重组DNA分子转化或侵染宿主细胞（7）重组克隆的筛选与保存3、简述自身引导法合成第二链cDNA的基本过程。自身引导合成第二链cDNA时,首先用氢氧化钠水解杂合双链中的mRNA链,解离的第一链cDNA的3端形成一个发夹环,作为合成第二链cDNA的引物,在Klenow DNA聚合酶的作用下合成第二链cDNA,再利用S1核酸酶切掉发夹环4、简述置换法合成第二链cDNA的基本过程。首先RNaseH在杂合双链的mRNA链上切出很多切口,作为一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合

21、成多个第二链cDNA的片段,再利用DNA连接酶连成完整的第二链cDNA5、简述引物-衔接头法合成第二链cDNA的基本过程。引物-衔接头合成法合成第二链cDNA是由引导合成法改进而来的,第一链cDNA合成后,直接利用末端转移酶在第一链cDNA的3端加上一段poly(dC)尾巴,然后以带接头序列的poly(dG)短核苷酸链作为引物,在Klenow DNA聚合酶的作用下合成第二链cDNA。6、简述常规PCR的基本原理。答：PCR是依据细胞内DNA半保留复制的机制，体外模拟DNA复制的技术。基本要素包括反应缓冲液、模板DNA、引物DNA、dNTP、DNA聚合酶、Mg2+等组分。模板DNA的高温变性、引物与模板低温退火（结合）、子链中温延伸个基本步骤构成PCR反应的一个循环。新合成的DNA链经变性后又可以作为下一轮PCR循环反应的模板，如此反复循环，使目的DNA呈倍性扩增。PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。21、简述普通PCR的基本程序答：预变性：92-98，DNA解螺旋；变性：92-98，双链DNA解链成