噬菌体展示技术

1、分子生物学综合性实验论文目录摘要2前言2材料与方法3-10结果与讨论10-14参考文献146致谢15 摘要本实验以学习基因克隆与转基因技术为目的，应用RT-PCR技术对目的基因进行克隆扩增，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。将cDNA在PCR中克隆成目的DNA片段，用T载体与RT-PCR产物连接再转入感受态细胞中进行复制，并以行蓝白斑筛选以及对阳性菌进行PCR鉴定。最后提取质粒DNA以及对质粒DNA进行酶切鉴定。最终成功提取目的基因并转基因成功。Thisexperimentisinordertostudygenecloningandtransgenictechnology.ApplingT-PCRtec

2、hnologyonthetargetgeneandtoclone.Afterthat,willThroughagarosegelelectrophoresis.ThecDNAisclonedintothepurposeofDNAfragmentswithPCR,andUsecarrierTandRT-PCRproduceoftheconnectionandthentransfertothecompetentcellsinreproduction.ThenBlueandwhitelinefilteraswellaspositivePCRforidentificationofbacteria.Fi

3、nally,aswellastheextractionofplasmidDNAplasmidDNAforenzymedigestion.Theultimatesuccessoftheextractedgeneandthesuccessofgeneticallymodified.前言RT-PCR，是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作“逆转录”由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA

4、聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。而琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶约可区分相差lOObp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb,利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。RT-PCR反应之后，TaqDNA聚合酶一般会在目的基因的3末端添加上一个A碱基，而T载体的3末端附带一个T碱基，扩增产物与T载体在连

5、接酶的作用下，通过碱基互补配对作用，就可形成牢固的重组克隆载体。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如a-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有卩-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到卩-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码卩-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样,lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主

6、细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为a-互补。由a-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无a-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37C温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。材料与方法3.1PBMC总RNA提取3.1.1仪器与试剂仪器与材料：低温高速离心机、移液器、DEPC水处理的EP管与枪头、一次性手套试剂：Trizol试剂

7、、氯仿、异丙醇、乙醇3.1.2方法EP管中加入大约107个PBMC细胞，800rpm室温离心2min，弃上清加入1mlTrizol试剂，并用移液器吹打均匀，室温放置5min加入200ul氯仿，振荡混匀，室温放置3min12000rpm，4C离心15minI离心后，EP管内溶液分为三层,，小心移取上层无色水样层，小心移至另一新EP管中I加入500ul异丙醇，室温放置15minI12000rpm，4C离心15min，这时会在EP管的底部看到白色沉淀；轻轻弃去上清I加入1ml75%乙醇（用DEPC处理的水配制）洗涤RNA沉淀I7500rpm，4C离心5min,弃上清I将EP管倒置，干燥，挥发剩余的乙

8、醇I用适量DEPC处理的水溶解RNA沉淀，推荐20ul3.2RTPCR、扩增产物纯化与琼脂糖凝胶电泳鉴定3.2.1仪器与试剂仪器：PCR仪、离心机、恒温水浴箱、电泳仪试剂：MgCl2、10XRTBuffer、RNaseFreeH20、dNTPMixture、RNaseInhibitor、AMVReverseTranscriptase、OligodT-AdaptorPrimer、5XPCRBufferdH20、dNTPMixture、TaKaRaExTaqHS、上下游PCR引物、凝胶回收试剂盒各试剂、TAEBuffer、电泳上样缓冲液、EB替代品、DNAMarker3.2.2方法3.2.2.1R

9、TPCR：A.反转录反应2ul1ul2ul1ul1ul按下列组成配制反转录反应液：MgCl210XRTBufferRNaseFreeH2OdNTPMixtureRNaseInhibitorTOC o 1-5 h zAMVReverseTranscriptase1ulOligodTAdaptorPrimer1ul实验样品RNA1ul按以下条件进行反转录反应。42C30min99C5min5C5min说明：ReverseTranscriptase能与cDNA结合，直接进行PCR反应有阻害作用。因此，PCR反应前，必须进行99C、5分钟加热使ReverseTranscriptase失活。B.PCR反

10、应按下列组成配制PCR反应液5XPCRBuffer10uldH2O25uldNTPMixture1ulTaKaRaExTaqHS1ul上游PCR引物2ul下游PCR引物2ulI把上述共40ul的反应液加入到A-2.反转录结束后的PCR反应管中轻轻混匀。3）按以下条件进行PCR反应。TOC o 1-5 h z94C2min94C30sec30Cycle55C30sec72C40sec72C7min4C3.2.2.2琼脂糖凝胶电泳取TAE缓冲液一定体积加入三角瓶后，加入一定质量的琼脂糖，使琼脂糖含量为1%（质量体积比）胶液的制备：将上述混合物放入或电炉上加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀。加热时应盖上

11、封口膜，以减少水份蒸发。待混合物冷却至50-60C时，加入一定量的EB替代物胶板的制备：将胶板两端分别用胶布紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子。然后将冷却好的混合物倒入胶槽中，倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶。然后向槽内加入TAE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液加样：所有样品（50ul）与5.5ul10X上样缓冲液混匀，小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染。注意上样时要

12、小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。恒流，85mA，电泳至指示剂跑到胶的1/2处即可停止紫外灯下观察电泳结果注：另做一个电泳并进行凝胶扫描3.2.2.3扩增产物的纯化：（该片段大于400bp，因此步骤7中不加异丙醇）在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖，转移入EP管中称量胶块重量为50.9mg，按1mg=1ul计算，胶块体积为50.9ul向胶块中加入胶块融化液DR-IBuffer153ul.将胶块切碎；混匀后75C加热融化胶块，间断振荡混合，使胶块充分融化向上述胶块融化液中加入77ulDR-IIBuffer，混匀将试剂盒中SpinColumn

13、安置于CollectionTube上I将上述操作的溶液转移至SpinColumn中，12000rpm离心1minI将滤液再加入SpinColumn中离心一次，弃滤液I将500ul的RinseA加入SpinColumn中，12000rpm离心1min，弃滤液I将700ul的RinseB加入SpinColumn中，12000rpm离心1min，弃滤液I重复操作将700ul的RinseB加入SpinColumn中，12000rpm离心1min，弃滤液I将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管中，在SpinColumn膜的中央处加入25ul已加热至60C的ElutionBuffer,室温静置

14、1分钟I12000rpm离心1min洗脱DNA。3.3RT-PCR产物克隆3.3.1仪器与试剂仪器：移液器（0.5-10微升、10-200微升，100-1000微升的量程）恒温水浴锅（16C）,冰盒，超净工作台，培养箱，摇床，玻璃试管，离心机，玻璃棒。试剂:PMD19-T载体试剂盒，0.1MCaCl2。菌株与培养基:大肠杆菌DH5a,LB（Amp-）培养基，含X-gal和IPTG的LB（Amp+）平板。3.3.2方法3.3.2.1RT-PCR产物与T载体的连接在洁净的PCR管中依次加入下列各组分：实验组（每组做一份）TOC o 1-5 h zpMD19-T载体1uLRT-PCR产物12uLdH

15、20upto5uL总体积5uL对照组（一个班做一个，第五组同学做）：pMD19-T载体1uLControlInsert1uLdH203uL总体积5uLI加入5uL（等量的）SolutionI,轻混反应物，并在16C连接反应30分钟（时间可延长）4.3.2.2大肠杆菌感受态细胞的制备以无菌铂丝蘸取大肠杆菌菌液在LB培养基（Amp-）平板上划线，倒置于培养箱中，37C培养12-16hI挑取单菌落，接种到含有2mlLB培养基（Amp-）的试管中，37C振荡过夜培养I以1%的接种量将菌液接种到2mlLB培养基（Amp-）的试管，37C振荡培养3h4h（此时菌液的A600值达到0.30.4）I室温下，以

16、5000rpm离心2min，回收细胞I在超净工作台里用枪头吸取上清弃掉，再用100ul预冷的0.1MCaCl2溶液重悬菌体（重悬时操作要轻），冰浴放置3.3.2.2大肠杆菌的转化（无菌操作）将连接产物（试验组和对照组）加入到制备好的感受态细胞里，用加样枪反复吹打，将质粒与感受态细胞混合均匀，冰浴3045min42C水浴热休克1.5min，时间到后迅速在冰上冷却2min加入ImLLB培养基（Amp-），37C180rpm震荡45分钟5000rpm离心2min，在超净工作台中用枪头吸取约900uL上清弃掉，用剩余的液体将细胞悬浮将悬浮细胞全部吸取并转移至含X-gal和IPTG的LB（Amp+）平板

17、上，用无菌玻璃棒涂布均匀，37C倒置培养过夜3.4转化子的筛选及PCR鉴定3.4.1仪器与试剂仪器：涂布器1个，灭菌牙签若干，灭菌试管若干，超净工作台1台，空气浴水平摇床1台，电泳仪及配套电泳槽1台，紫外检测仪1台，移液器（200-1000ul）1支，移液器（5-200ul）1支，移液器（0.5-10ul）1支；试剂：LB/Amp液体培养基5mlAmp的终浓度为0.1g/L（以1LLB/Amp液体培养基为例，Amp的含量为100mg。配置1LLB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基（举例说明）：终浓度试剂用量0.04mg/mlX-Gal40mg0.024mg/mlIPTG24mg1%(W/

18、V)Tryptone10g0.5%(W/V)YeastExtract5g1%(W/V)NaCl10g0.1mg/mlAmpicillin100mg1.5%(W/V)Agar15g菌落PCR：TOC o 1-5 h z10XPCRBuffer5uldNTPmix2ulPrimer1#5ulPrimer2#5ulExTaqDNApolymerase1ul(原体积为0.25ul，已用0.75ul10XPCRBuffer稀释至1ul)琼脂糖，0.5g I 1XTAE电泳缓冲液，200ml6X加样缓冲液（含DNA染料），5ul3.4.2方法3.4.2.1蓝白斑平板的制作（以下平板配置各试剂的剂量以1L为

19、例进行说明）:称取下列试剂，置于1L烧杯中TOC o 1-5 h zTryptone10gYeastExtract5gNaCl10g加入约800ml的去离子水，充分搅拌混匀滴加5NNaOH（约0.2ml）,调节PH值至7.0加去离子水将培养基定容至1L后，加入15gAgarI高温高压灭菌后，冷却至60度左右I加入1mlAmpicillin(100mg/ml)、1mlIPTG(24mg/ml)、2mlX-Gal(20mg/ml)后均匀混I铺制平板（30-35ml培养基/90mm培养皿）I4度避光保存,一般存放24小时后才开始使用I做转化液涂布平板操作时，提前1-2小时将平板从4度冰箱取出，室温避

20、光温育，以待涂布使用I见实验三中具体转化操作I次日从37度温箱中取出平板观察，蓝色菌落即初步认定为未转化菌，白色菌落初步认定为转化子3.4.2.2菌落PCR:按顺序在0.2mLEppendorf管中加入TOC o 1-5 h z10XPCRBuffer2uldNTPmix1ulPrimer1#2ulPrimer2#2ulExTaqDNApolymerase(5U/ul)1ul（原体积为0.25ul，已用0.75ul10XPCRBuffer稀释至1ul）加灭菌水到总体积20ul常温下随机挑选一个转化板上的转化子，用灭菌的牙签挑取少量菌体；然后将沾有菌体的牙签浸入装有PCRmixture的Eppe

21、ndorf管中数秒，即将同根牙签放入一支装有约5mlLB/Amp培养基的试管中洗涤数次，以作扩增培养细菌用；另取一0.2mLEppendorf管，先进行操作（2）的操作，但不加转化子模板，作为阴性对照。将以上两个0.2mLEppendorf管离心数秒后，放入PCR仪，设置反应程序：第一步：94C预变性5min；第二步：PCR扩增30次循环：94C变性反应45s；55C退火反应30s；72C延伸反应30s第三步：72C适温延伸反应7min取5ulPCR反应产物口lul含DNA染料的加样缓冲液，1%琼脂糖电泳分析（注意：同时电泳标准DNA分子量Marker和不加模板的阴性对照样品）紫外检测仪下观察

22、并记录扩增片段大小洗涤过有菌牙签的试管，空气摇床37C,180-200rpm过夜（12-14hr）扩增培养，以备后续实验质粒提取及酶切使用3.5重组质粒提取与酶切鉴定3.5.1仪器与试剂质粒提取试剂：含质粒DNA的过夜培养的DH5a菌株LB菌液1.5ml;溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0）,10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液I可成批配制，每瓶100ml,高压灭菌15分钟，储存于4C冰箱，溶液II：0.2mol/LNaOH，1%SDS；溶液II需要使用前新鲜配置，给大家提供5mol/LNaOH和10%SDS，按照5mol/LNaOH20ul，1

23、0%SDS50ul，无菌蒸馏水430ul，混合配置成500卩l溶液II；溶液III（乙酸钾溶液）：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml,H2O28.5ml，定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L,Ac5mol/L；异丙醇、7.5mol/L的NH4Ac溶液、无水乙醇、70%乙醇；酶切鉴定试剂：限制性内切酶酶切所需试剂：质粒DNA、EcoRI、HindIII和酶切反应缓冲液；琼脂糖凝胶电泳所需试剂和设备：1%的琼脂糖凝胶，TBE电泳缓冲液，10X加样缓冲液，DNA染料，琼脂糖凝胶电泳槽，电泳仪和紫外检测仪。3.5.2方法3.5.2.1重组质粒提取取1.5ml培养液倒

24、入1.5mlEP管中，12000r/min离心1分钟，弃上清，将管倒置于吸水纸上数分钟，使液体流尽加入100卩l溶液I,用枪头重悬菌体沉淀，重悬一定要充分均匀，不能留有细菌团块（可用振荡器振荡）加入新配制的溶液II200ul,盖紧管口，立即上下颠倒4-5次，使沉淀混匀加入150卩l预冷的溶液III,盖紧管口，上下颠倒EP管5-10次，使沉淀混匀，冰浴3分钟12000r/min离心5分钟I用黄枪头小心将上清转移到一新EP管中，注意不要将沉淀物吸起，再加入等体积酚氯仿,混匀I12000r/min离心2分钟I将上清移至一新EP管中，加入两倍体积的无水乙醇I12000r/min离心5分钟，弃上清I加入

25、lml70%的乙醇，用枪头轻轻吹打洗涤沉淀，注意不要将沉淀打碎或吸走I12000r/min离心5分钟，小心用弃去上清，注意不要将沉淀倒走I将EP管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥I用20ul含RNaseA的无菌蒸馏水溶解提取物，室温放置，充分溶解DNA3.5.2.2酶切鉴定在EP管内加入酶切反应体系（20ul）TOC o 1-5 h z质粒DNA10ul10X酶切反应缓冲液2ulEcoRI1ulHindIII1ul无菌蒸馏水6ulI离心混匀，37C水浴反应34小时I制备1%的琼脂糖凝胶板I取酶切后全部DNA样品加入上样缓冲液混匀I上样进行琼脂糖凝胶电泳I紫外监测仪观察结果5.结果与讨论（

26、第五组实验组）5.1结果M112233图1.PCR产物电泳凝胶扫描图图2.PCR产物回收电泳凝胶扫描图M12345图4.PCR鉴定电泳凝胶扫描图图5.酶切鉴定电泳凝胶扫描图5.2讨论PBMC总RNA提取本实验关键在于严格控制RNA酶的污染，总RNA提取时，难免同学间需交流与沟通,而RNA酶几乎无处不在，也存在于唾液中，因而可能影响RNA提取；同时，也还需从实验用品与仪器、试剂等防止污染。实验过程中曾由于操作者的粗心，曾把无水乙醇误当75%乙醇加入沉淀中，需再次离心与挥发后再重复此步骤，可能因此而减少RNA提取率。离心后吸取上清，宁可少吸也不可多吸，防止将杂质一并吸入。RTPCR、扩增产物纯化与

27、琼脂糖凝胶电泳鉴定配制PCR反应液时，应最后加入酶，防止酶在不宜条件下已进行催化。而EB为强致癌物质，操作者需带手套且谨慎操作。倒胶时，凝胶温度不可太低，防止凝胶凝固得不均匀;速度也不能太快，否则易出现气泡图1.PCR产物电泳凝胶扫描图，目的DNA大小为420bp左右，条带下方有少量非特异性杂质，出现此现象可能与和引物的非特异性及退火温度有关。在该出现目的条带的前方出现弥散的拖尾现象（maker未出现拖尾现象），估计是由于首次上样，操作者操作不熟悉,l3上样时少量样品益出造成，相信以后更加小心加样，多加练习，可准确无误上样。此外，也有可能电压太高导致各组同样出现拖尾现象。进行切胶时，小心将非特异条带切去，并尽量减少凝胶体积，为提高回收率,也要注意将DNA不要将长时间暴露在紫外灯下,以防止DNA损伤。图2.PCR产物回收电泳凝胶扫描图中，条带位于420bp左右的位置，显示出成功回收DNA,未出现非特异性条带。但是条带偏前，可能由于DNA呈闭环状态，跑电泳的速度较快，因而条带相对其它组的条带都要偏前。RT-PCR产物克隆当外源片段插入到质粒载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的N端片段失去a互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。实验中蓝白斑平板中出现分布稀疏的白色菌落，并无蓝斑菌落，初