SDS-PAGE检测重组蛋白

1、SDS检测重组蛋白一、实验目的 = 1 * GB3 掌握SDS的基本原理； = 2 * GB3 掌握SDS的凝胶制备方法； = 3 * GB3 掌握握蛋白质质的考马马斯亮蓝蓝染色法法；= 4 * GB3 掌握握测定重重组蛋白白分子量量的方法法。二、实验验原理：1、聚丙丙烯酰胺胺凝胶电电泳（PPAGEE）聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳（pollyaccryllamiide gell ellecttropphorresiis），简称PPAGEE，是以以聚丙烯烯酰胺凝凝胶作为为支持介介质。聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶是由单单体的丙丙烯酰胺胺（accryllamiide）和甲叉叉双丙烯烯酰胺（bissacrrylaa

2、midde）聚聚合而成成，这一一聚合过过程需要要有自由由基催化化完成。催化剂剂过硫酸酸铵（AAP）可可产生自自由基，而加速速剂四甲甲基乙二二胺（TTEMEED）可可催化过过硫酸铵铵加速自自由基的的产生，这样就就可以形形成丙烯烯酰胺长长链，同同时甲叉叉双丙烯烯酰胺在在不断延延长的丙丙烯酰胺胺链间形形成甲叉叉键交联联，从而而形成交交联的三三维网状状结构。氧气对对自由基基有清除除的作用用，在制制备聚丙丙烯酰胺胺凝胶时时通常要要进行抽抽气，或或者用水水或正丁丁醇隔绝绝氧气。聚丙烯酰酰胺凝胶胶的孔径径可以通通过改变变丙烯酰酰胺和甲甲叉双丙丙烯酰胺胺单体的的浓度来来控制，丙烯酰酰胺的浓浓度可以以在330%

3、（V/V）之之间。低低浓度的的凝胶具具有较大大的孔径径，如33%（VV/V）的聚丙丙烯酰胺胺凝胶对对蛋白质质没有明明显的阻阻碍作用用，可用用于SDDS-PPAGEE的浓缩缩胶，也也可以用用于分离离DNAA。高浓浓度凝胶胶具有较较小的孔孔径，对对蛋白质质有分子子筛的作作用，可可以用于于根据蛋蛋白质的的分子量量进行分分离的电电泳中，如100200%（VV/V）的凝胶胶常用于于SDSS-PAAGE的的分离胶胶。聚丙烯酰酰胺凝胶胶具有以以下突出出的优点点：（11）可以以随意控控制胶浓浓度和交交联度，从而得得到不同同的有效效孔径，用于分分离不同同分子量量的生物物大分子子；（22）能把把分子筛筛作用和和电

4、荷效效应结合合在同一一方法中中，达到到更高的的灵敏度度：100-9110-112 mmol/L；（3）由由于聚丙丙烯酰胺胺凝胶是是由-CC-C-键结合合的酰胺胺多聚物物，侧链链只有不不活泼的的酰胺基基-COO-NHH2-，没没有带电电的其他他离子基基团，化化学惰性性好，电电泳时不不会产生生“电渗”；（44）由于于可以制制得高纯纯度的单单体原料料，因而而电泳分分离的重重复性好好；（55）透明明度好，便于照照相、扫扫描或复复印。机机械强度度好，有有弹性，不容易易破碎，便于操操作和保保存；（6）无无紫外吸吸收，不不需染色色就可以以用于紫紫外波长长的凝胶胶扫描作作定量分分析；（7）还还可以用用作固定定

5、化酶的的惰性载载体。聚丙烯酰酰胺凝胶胶分离蛋蛋白质最最初是在在玻璃管管中进行行的，后后来发展展起来的的垂直平平板电泳泳一次最最多可以以容纳220多个个样品，电泳过过程中样样品所处处的条件件比较一一致，样样品间可可以进行行更好的的比较，重复性性也更好好，所以以垂直平平板电泳泳目前应应用得最最更为广广泛，常常用于蛋蛋白质的的分离和和分子量量的测定定，以及及DNAA序列分分析过程程中的DDNA片片段的分分离和鉴鉴定。2、SDDS-PPAGEE十二烷基基硫酸钠钠-聚丙丙烯酰胺胺凝胶电电泳（SSDS-PAGGE）是是根据SSDS和和还原剂剂将蛋白白质分子子解聚后后亚基的的大小，在恒定定pH（碱性）缓冲体

6、体系中的的分离。主要用用于测定定蛋白质质亚基的的分子量量。与超超速离心心、凝胶胶过滤相相比，SSDS-PAGGE不需需要昂贵贵的仪器器设备，操作简简便，能能在几个个小时内内得到结结果，有有较高的的重复性性，且不不需要非非常纯的的样品，是目前前为大家家所接受受的用于于测定亚亚基的分分子量的的一种最最好的方方法。这这个方法法可用于于多肽分分子量的的分析，或用于于变性蛋蛋白的分分离等。SDS是是一种阴阴离子去去污剂，作为变变性剂和和助溶剂剂，能断断裂分子子内和分分子间的的氢键，使分子子去折叠叠，破坏坏蛋白质质分子的的二级结结构和三三级结构构。强还还原剂，如-巯基基乙醇、二硫苏苏糖醇（DTTT）则能能

7、使半胱胱氨酸残残基之间间的二硫硫键断裂裂。在样样品和凝凝胶中加加入SDDS和还还原剂后后，在1100加热35分钟钟，分子子被解聚聚为组成成它们的的多肽链链。解聚聚后的氨氨基酸侧侧链与SSDS充充分结合合形成带带负电荷荷的蛋白白质-SSDS胶胶束，所所带的负负电荷大大大超过过了蛋白白质分子子原有的的电荷量量，这就就消除了了不同分分子之间间原有的的电荷差差异。因因此，结结合了SSDS的的蛋白质质可以在在聚丙烯烯酰胺凝凝胶中向向正极泳泳动，同同时由于于聚丙烯烯酰胺凝凝胶的分分子筛效效应，蛋蛋白质在在凝胶中中的迁移移率主要要决定于于自身分分子量的的大小，即分子子量小的的蛋白质质分子通通过凝胶胶孔的阻阻

8、力小，迁移快快，而分分子量大大的蛋白白质分子子通过凝凝胶孔的的阻力大大，迁移移慢。SDS-PAGGE分离离不同蛋蛋白质时时的高分分辨率，不仅是是因为聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶介质本本身的特特点，还还归功于于在电泳泳时采用用了不连连续系统统。不连连续系统统对样品品具有浓浓缩效应应，从而而提高了了分离效效果。（1）凝凝胶层的的不连续续。浓缩缩胶的孔孔径大，分离胶胶孔径小小，在电电场的作作用下，蛋白质质颗粒在在大孔胶胶中泳动动时遇到到的阻力力小，移移动快，而在小小孔胶中中移动慢慢。因而而在两层层凝胶交交界处，由于凝凝胶孔径径的不连连续性，使样品品迁移受受阻，而而压缩成成很窄的的区带。（2）缓缓冲液离离子成

9、分分及pHH的不连连续。在在两层凝凝胶中均均有Trris（三羟甲甲基氨基基甲烷）及HCCl。TTriss的作用用是维持持溶液的的电中性性及pHH值，是是缓冲配配对离子子，HCCl在任任何pHH值溶液液中均易易解离出出Cl-（氯离离子），它在电电场中迁迁移率大大，走在在最前面面，故称称为快离离子或前前导离子子。电极极缓冲液液中的GGly（甘氨酸酸）在ppH6.8的缓缓冲体系系中解离离度很小小，仅00.1-1%，因而在在电场中中迁移率率很小，称为慢慢离子或或尾随离离子。蛋蛋白质-SDSS复合物物带有负负电荷，在pHH6.88的浓缩缩胶中，向正极极泳动，迁移率率介于快快慢离子子之间，于是蛋蛋白质就就

10、在快慢慢离子间间形成的的界面处处，被浓浓缩成极极窄的区区带。当当蛋白质质进入ppH8.8的分分离胶中中，Glly的解解离度增增加，其其迁移率率就超过过蛋白质质，因此此氯离子子和甘氨氨酸离子子沿着离离子界面面继续前前进。蛋蛋白质由由于分子子量大，被留在在后面，然后分分成多个个区带，因此浓浓缩胶与与分离胶胶之间ppH值的的不连续续性，能能控制迁迁移率：在浓缩缩胶中，要求慢慢离子较较所有被被分离样样品的有有效迁移移率低，以使样样品在快快慢界面面之间被被浓缩；进入分分离胶后后，慢离离子的有有效迁移移率比所所有样品品的有效效迁移率率高，使使样品不不再受离离子界面面的影响响。（3）电电位梯度度的不连连续。

11、电电位梯度度的高低低与电泳泳速度的的快慢有有关（VV=mEE）。电电泳开始始后，由由于快离离子迁移移率大，就会很很快超过过蛋白质质，在快快离子后后面形成成一个离离子浓度度低的区区域即低低电导区区，有较较高的电电位梯度度，使蛋蛋白质和和慢离子子在快离离子后面面加速泳泳动。当当三者的的迁移率率与电位位梯度的的乘积彼彼此相等等时，三三者的泳泳动速度度就相等等。在快快慢离子子的移动动速度相相等的稳稳态建立立后，二二者之间间形成一一个稳定定而又不不断向阳阳极移动动的界面面，而蛋蛋白质的的有效迁迁移率在在快慢离离子之间间，因此此也就聚聚集在这这个移动动附近，被压缩缩成一个个狭小的的中间层层。3、蛋白白质（

12、亚亚基）分分子量的的测定蛋白质-SDSS胶束在在水溶液液中的形形态，就就像一个个长椭圆圆棒，椭椭圆棒的的短轴对对不同的的蛋白质质亚基-SDSS胶束而而言，基基本上都都是相同同的，约约为1.8 nnm。但但长轴的的长度则则与亚基基分子量量的大小小成正比比。因此此这种胶胶束在进进行SDDS-PPAGEE时，电电泳迁移移率不再再受到蛋蛋白质原原有电荷荷的影响响，而主主要取决决于椭圆圆棒的长长轴长度度，即取取决于蛋蛋白质或或亚基分分子量的的大小。当蛋白白质亚基基的分子子量在1152200 kDaa之间时时，电泳泳迁移率率与分子子量的对对数呈线线性关系系。由此此可见，SDSS-PAAGE不不仅可以以分离

13、蛋蛋白质，而且可可以根据据迁移率率大小测测定蛋白白质亚基基的分子子量。蛋蛋白质或或亚基分分子量的的测定，可根据据蛋白质质标准（蛋白质质Marrkerr）测定定，或根根据相对对迁移率率进而更更精确地地测定分分子量。现在市售售的蛋白白质Maarkeer大多多是由一一系列纯纯化的、具有不不同分子子量的蛋蛋白质组组成的，它们之之间不会会发生相相互作用用，在进进行SDDS-PPAGEE时具有有良好的的线性关关系。例例如本实实验中采采用的低低分子量量蛋白质质Marrkerr为BBBI公司司产品，由磷酸酸酶b（兔子肌肌肉）、牛血清清蛋白（牛）、卵清蛋蛋白（鸡鸡蛋白）、碳酸酸苷酶（牛）、溶菌酶酶（鸡蛋蛋白）五

14、五种蛋白白质组成成，其分分子量依依次为997.44 kDD，666.2 kD，42.7 kkD，331.00 kDD，144.4 kD。在电泳泳时，将将蛋白质质Marrkerr点入与与样品相相邻的泳泳道，其其各蛋白白质组分分将在电电泳过程程中相互互分离。根据分分子量相相近的蛋蛋白质具具有相近近的迁移移率这一一原则，可以借借助于蛋蛋白质MMarkker初初步确定定目的蛋蛋白的分分子量。为了在在电泳时时即时观观察蛋白白质的分分离情况况，还可可以采用用已经经经过着色色的蛋白白质Maarkeer，通通常称为为“彩虹”蛋白质质Marrkerr。另外，我我们还可可以根据据蛋白质质Marrkerr中各种种蛋

15、白质质的相对对迁移率率，作出出标准曲曲线，从从而更精精确地测测定目的的蛋白的的分子量量。蛋白白质的迁迁移距离离，即从从分离胶胶的上沿沿至蛋白白带的中中央的距距离，可可以用直直尺直接接测得，而蛋白白质的相相对迁移移率Rff是用每每个蛋白白带的迁迁移距离离除以溴溴酚蓝的的迁移距距离得到到，即：Rf = 蛋白白带的迁迁移距离离/溴酚酚蓝的迁迁移距离离如果凝胶胶厚度大大于1mmm，由由于染色色、脱色色和保存存过程中中凝胶的的膨胀或或收缩，所以必必须测量量固定前前和干燥燥后的凝凝胶的尺尺寸来消消除这种种误差，其公式式为：Rf =（蛋白白带的迁迁移距离离/干燥燥后的凝凝胶长度度）（固定定前的凝凝胶长度度/

16、溴酚酚蓝的迁迁移距离离）用每个标标准蛋白白的分子子量的对对数（纵纵坐标）对它的的相对迁迁移率（横坐标标）作图图就能得得到一条条直线。量出目目的蛋白白的迁移移距离，计算出出相对迁迁移率，就可以以根据标标准曲线线计算出出其分子子量。不不同，这这样的标标准曲线线只对同同一块凝凝胶上的的样品的的分子量量的测定定才具有有可靠性性。此外，使使用凝胶胶扫描或或影像文文件处理理系统，便可以以很快读读出目的的蛋白的的分子量量。三、实验验材料1、生物物材料 经IPPTG诱诱导的含含有重组组质粒ppET228a-egffp，ppET228a-rfpp或pETT28aa-Dvgsst的基因工工程菌的的总蛋白白（由实实

17、验二获获得）。2、主要要试剂（1）用用于SDDS-PPAGEE凝胶的的制备：30%丙烯酰酰胺凝胶胶母液（丙烯酰酰胺:双双甲叉丙丙烯酰胺胺=299:1），200%SDDS，11.5 M TTriss-HCCl（ppH6.8），1.0 M TTriss-HCCl（ppH8.8），10%过硫酸酸铵（AAP），四甲基基乙二胺胺（TEEMEDD），去去离子水水；（2）用用于SDDS-PPAGEE凝胶的的电泳：1Triis-甘甘氨酸电电泳缓冲冲液；（3）用用于SDDS-PPAGEE凝胶的的考马斯斯亮蓝染染色：甲甲醇，乙乙酸，考考马斯亮亮蓝；（4）用用于SDDS-PPAGEE凝胶的的硝酸银银染色：乙醇，乙酸

18、，乙酸钠，25%戊二醛醛，硫代硫硫酸钠，硝酸银银，甲醛醛，碳酸钠钠，EDDTA-Na222H2O。3、主要要仪器玻璃制胶胶板，垂垂直电泳泳槽，电电泳仪，染色与与脱色摇摇床，凝凝胶成像像系统。四、实验验步骤1、SDDS-PPAGEE凝胶的的制备（1）正正确安装装制胶板板，用琼琼脂糖凝凝胶密封封底部及及侧面，以免PPAGEE胶液泄泄漏。（2）在在1500ml三三角瓶中中配置880mll 122%分离胶胶，混匀匀，沿玻玻璃板边边缘缓缓缓加入制制胶槽，加至距距梳齿约约1cm处，留出浓浓缩胶的的空间。12%分分离胶（80mml）：26.8mll H22O，322.0mml 330%凝凝胶母液液，200.

19、0ml1.5M Triis（ppH8.8），0.44 mll 20%SDSS，0.8 mml 110%AAP，32l TTEMEED。注意：丙丙烯酰胺胺具有一一定的神神经毒性性，操作作时戴一一次性手手套；加加入凝胶胶时动作作要轻缓缓，以免免产生气气泡。（3）用用1mll移液器器轻轻加加入适量量去离子子水作为为覆盖层层静置约约30miin使凝凝胶完全全聚合。注意：水水作为覆覆盖层可可使凝胶胶表面变变得平整整，并可可防止氧氧气对凝凝胶聚合合反应的的抑制作作用。（4）倒倒出覆盖盖层中的的水，去去离子水水洗涤凝凝胶顶部部数次，以去除除未参与与聚合反应应的丙烯烯酰胺，用纸巾巾吸尽残残留液体体。（5）在在

20、1500ml三三角瓶中中配置440mll 5%浓缩胶胶，混匀匀，轻轻轻加在分分离胶上上面，插插入梳子子，静置置约300minn，使凝胶胶完全聚聚合。5%浓缩缩胶（440mll）：227.44ml H2O，6.8mll 300%凝胶胶母液，5.00ml1.0M Triis（ppH 66.8），0.22ml 220%SSDS，0.66ml 10%AP，24l TTEMEED。注意：加加入浓缩缩胶时动动作要轻轻缓，以以免产生生气泡；插入梳梳子时避避免在梳梳齿下方方产生气气泡。（8）在在垂直电泳泳槽中加加入1Triis-甘甘氨酸电电泳缓冲冲液，轻轻轻拔出出梳子，用滴管管或移液液器轻轻轻冲洗加加样孔，去

21、除未未聚合的的丙烯酰酰胺，并并用细针针拨直凝凝胶齿。1Trris-甘氨酸酸电泳缓缓冲液：25mM Trris，250mmM甘氨酸酸，0.1% SDSS。2、点样样与电泳泳（1）点点样：在在加样孔孔中依次次加入115l样品：0h、1h、2h、3h、4h，并在样样品的相相邻泳道道点入蛋蛋白质MMarkker。（2）电电泳：接接通电源源，起始始电压880V；当染料料前沿进进入分离离胶后，提高电电压至1120VV，电泳泳约2-5h。（3）待待溴酚蓝蓝前沿到到达电泳泳槽底部部时，切切断电源源，戴手套取取出玻璃璃板，小小心从玻玻璃板上上剥下凝凝胶以免免破损，弃除浓浓缩胶，在分离离胶右下下角切去去一小片片，

22、作为定定位标记记。3、考马马斯亮蓝蓝染色与与脱色（1）将将分离胶胶放入染染色液，置摇床床上缓慢慢摇动，染色44h以上上或过夜夜。染色液：90mml甲醇醇:水（11:1），10mml乙酸酸，0.25gg考马斯斯亮蓝。注意：戴戴一次性性手套操操作，以以免手上上染色。（2）取取出分离离胶，用用蒸馏水水漂洗数数次，将将胶放入入脱色液液，置摇摇床上缓缓慢摇动动2-44小时，直至背背景蓝色色褪淡，见到条条带，期期间应更更换脱色色液3-4次。脱色液：90mml甲醇醇:水（11:1），10mml乙酸酸。注意：戴戴一次性性手套操操作，以以免手上上染色；回收染染色液，可反复复使用多多次。（3）测测量蛋白白质Maa

23、rkeer中各各蛋白质质、溴酚酚蓝、重重组蛋白白质的迁迁移距离离，计算算它们的的相对迁迁移率RRf，利用用蛋白质质Marrkerr中各蛋蛋白质的的相对迁迁移率RRf和各蛋蛋白质的的分子量量作标准准曲线，并根据据该标准准曲线推推算重组组蛋白的的分子量量。4、硝酸酸银染色色（1）固固定：配配制固定定液（5500 ml乙乙醇，1100乙乙酸，4400mml ddd HH2O），处处理至少少30mmin。（2）浸浸泡：配配制浸泡泡液（775mll乙醇，17gg乙酸钠，1.225mll 255% 戊戊二醛，0.55g硫代代硫酸钠钠，用ddd HH2O溶解解后加至至2500ml），浸泡泡30 minn。（3）漂漂洗：用用dd H2O漂洗洗三次，每次55minn。（4）银银染：配配制银染染液（0.25gg硝酸银银，500l甲醛醛，用ddd H22O溶解解后加至至2500ml），染色色20 minn。（5）显显色：配配制显色色液（66.255g碳酸酸钠，225l甲醛醛，用ddd