细胞生物学实验手册：培养细胞的形态观察和计数

1、实验十三 培养细胞的形态观察和计数【实验目的】了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态；掌握细胞计数的基本方法。【实验用品】 一、材料和标本 培养中的HeLa细胞(人子宫颈癌上皮细胞)、NIH3T3(小鼠成纤维细胞)、HL一60细胞(人白血病细胞) 二、器材和仪器 倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管 三、试剂 0.3台盼兰染液、0.25胰蛋白酶一0.02EDTA混合消化液【实验内容】 一、培养细胞的形态观察 (一)原理 体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞，如HeLa细胞、NH3T3等，叫贴壁型细胞，体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞并不贴

2、附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如HL60，叫做悬浮型细胞，这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。 (二)操作 l将细胞培养瓶从37二氧化碳培养箱(或温箱)中取出，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上，此时应注意不要将瓶翻转，也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。 2打开倒置镜光源，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。 3调节载物台的高度进行对焦，在看到细胞层之后，再用细调节器将物像调清楚，注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是10X物镜。 (三)结果 贴壁细胞一般有两种形状，即上皮细胞形和成纤维细胞形细胞。上皮细胞形细胞

3、呈扁平的不规则多角形，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片，如HeLa细胞。成纤维细胞形细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆核，胞质向外伸出23个长短不同的突起，细胞群常借原生质突连接成网，如 NIH3T3(参照照片)。 贴壁细胞在生长状态良好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡，细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多时，表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可能。悬浮细胞当边缘清楚，透明发亮时，生长较好；反之，则较差或已死亡。由于培养基内有pH指示剂的存在，因此它的颜色往往可以间接

4、地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。实际上，一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的，它随营养、pH、生长周期而改变，但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中，镜下折光率高，圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。 二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定 (一)在细胞生物学的实验中，往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度，是进行实验必不可少的一种基本技能。图131 细胞计数板顶面观和侧面观的图示图132 放大的计数室 (二)操作 1

5、将培养瓶中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶中加入0.25胰蛋白酶一0.02EDTA混合消化液lml,静置35分钟，待见到细胞变圆，彼此不连接为止。 2将试管中的培养液倒回培养瓶中，并轻轻进行吹打，制成细胞悬液。 3取细胞悬液0.5ml，加入0.3台盼兰染液0.5ml，混合后染色35分钟。 4滴加少许已染色的细胞悬液于放有盖片的细胞计数板的斜面上，使液体自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。 5在普通光镜10X物镜下计数四个大格内(如图131，132示)的细胞数，压线者数上不数下，数左不效右。 (三)结果 按下式进行细胞浓度的计数： 注 4大格中的每一大格体积为0.1m

6、m3。1ml=l，0000大格，因此，1大格细胞数104=细胞数ml。 注 染色标本在15分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞染上蓝色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。 进行细胞计数时应力求准确，因此，在科学研究中，往往将计数板的两侧都滴加上细胞悬液，并同时滴加几块计数板(或反复滴加一块计数板几次)，最后取结果的平均值。【作 业】一、问题下面是某些贴壁细胞培养数天后观察计数的结果： 瓶 培 养 基 镜 下 观 察 计 数清澈度颜 色细胞界限胞内颗粒空泡 碎片总死 甲 乙 丙 丁 混蚀 清 清 清 黄橙黄 黄紫红 不清 清楚 清楚 不清 多 少较多 多多大 少 有 多满视野 无 有 多 6104 9104 2106 2104 5104 21025104 11041根据上表分析各瓶细胞的生长情况是：A 细胞生长状态良好；B 培养时间太短；C 细胞污染可能性大；D 细胞与环境生长不适；E 细胞营养不足。甲( ) 乙( ) 丙( ) 丁( )2根据你的判断应采取的措施是：A 将细胞弃去； B 立即换新鲜培养液；C 立