DNA生物合成市公开课金奖市赛课一等奖课件

1、DNA复制All Right Reserved by Liuwanh重庆科技学院化学化工学院第1页课程：生物化学主讲：刘万宏中心法则重点知识回顾DNA经过复制将遗传信息由亲代传递给子代；经过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物表型。DNA复制、转录和翻译过程就组成了遗传学中心法则。第2页课程：生物化学主讲：刘万宏DNA双螺旋结构重点知识回顾DNA合成原料是dNTP核苷酸经过磷酸3，5-二酯键连接DNA中碱基互补配对第3页课程：生物化学主讲：刘万宏DNA双螺旋结构重点知识回顾1.主干链反向平行2.侧链碱基互补配对3.立体构象双螺旋第4页课程：生物化学主讲：刘万宏问题提出1DNA为

2、何需要复制？2DNA复制过程有没有共性？3DNA复制过程怎样？第5页课程：生物化学主讲：刘万宏本章内容第5节： DNA损伤与修复 第4节：逆转录和其它复制方式第3节：DNA复制过程第2节：DNA复制酶学第1节：复制基本规律内容提要第6页课程：生物化学主讲：刘万宏第1节.复制基本规律1.1半保留复制1.1半保留复制概念半保留复制（semiconser-vative replication）：DNA在复制过程中合成新链与亲代DNA分子碱基次序完全一样。因为子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成，这种复制方式称为半保留复制。复制亲代DNA子代DNA新合成子链第7页课程：生物化学主讲：刘万宏

3、第1节.复制基本规律1.1半保留复制半保留复制试验证据以15NH4Cl为唯一氮源培养大肠杆菌，使其DNA全部变成15NDNA；Step 1Step 2Step 3Step 4将上述细菌转入普通培养基（含14NH4Cl）培养；提取各代细菌中DNA分子；氯化铯密度梯度离心，分析沉降区域密度。米西尔逊-斯塔尔试验 第8页课程：生物化学主讲：刘万宏第1节.复制基本规律1.2复制子与复制方向概念复制子(replicon) ：复制子是独立完成复制功效单位。习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间距离（或DNA片段）定为一个复制子。单向复制双向复制复制方向第9页课程：生物化学主讲：刘万宏第1节.复制基本规律1.

4、3需要引物知识点参加DNA复制DNA聚合酶，必须以一段含有3端自由羟基（3-OH）RNA作为引物(primer) ，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物大小，在原核生物中通常为50-100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物碱基次序，与其模板DNA碱基次序相配对。第10页课程：生物化学主讲：刘万宏第1节.复制基本规律1.4半不连续复制35353535解链方向领头链(leading strand)随从链(lagging strand)35第11页课程：生物化学主讲：刘万宏第1节.复制基本规律1.4半不连续复制概念领头链(leading strand）以35方向亲代DNA链作模板子

5、代链在复制时基本上是连续进行，其子代链聚合方向为53，这一条链被称为领头链(leading strand)。随从链(lagging strand)以53方向亲代DNA链为模板子代链在复制时则是不连续，其链聚合方向也是53，这条链被称为随从链(lagging strand)。冈崎片段(Okazaki fragment)因为亲代DNA双链在复制时是逐步解开，所以，随从链合成也是一段一段。DNA在复制时，由随从链所形成一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。第12页课程：生物化学主讲：刘万宏第2节：DNA复制酶学DNA复制体系 复制是在酶催化下核苷酸聚合过程,需要各种物质

6、共同参加: 底物：dNTP (dATP、dGTP、dCTP、dTTP) ； 模板(template)：解开成单链DNA母链； 引物(primer)：提供3-OH末端寡核苷酸（RNA分子）； 聚合酶(polymerase)：依赖DNADNA聚合酶，简写为DNA-pol 或DDDP； 其它酶和蛋白质因子DNA复制体系第13页课程：生物化学主讲：刘万宏第2节：DNA复制酶学1.解旋解链酶拓扑异构酶（解超螺旋酶）：解开DNA超螺旋解链酶（解螺旋酶）：解开碱基对之间氢键，形成2股单链单链DNA结合蛋白：结合于单股DNA链，阻止DNA复性,预防单链被核酸酶水解（辅助因子，非酶）2.引物酶：合成一小段RNA

7、引物，用于DNA聚合酶延长子链3.DNA聚合酶：在5端由RNA（或DNA）前提下，延长DNA子链4.DNA连接酶：在随从链合成过程中，将不连续DNA子链片段连接第14页课程：生物化学主讲：刘万宏第2节：DNA复制酶学2.1 解旋解链酶拓扑异构酶第15页课程：生物化学主讲：刘万宏第2节：DNA复制酶学2.1 解旋解链酶解链酶解螺旋酶(helicase) ，又称解链酶或rep蛋白，利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些

8、能够与单链DNA结合蛋白质因子。其作用为： 使解开双螺旋后DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA； 保护单链DNA，防止核酸酶降解。SSB第16页课程：生物化学主讲：刘万宏第2节：DNA复制酶学2.2 引物酶引物酶引物酶(primerase)本质上是一个依赖DNARNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由3-OH，使子代DNA链能够开始聚合。第17页课程：生物化学主讲：刘万宏第2节：DNA复制酶学2.3 DNA聚合酶DNA聚合酶当前发觉DNA聚合酶有三种，分别命名为DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（po

9、l ），DNA聚合酶（pol ），这三种酶都属于含有各种酶活性多功效酶。参加DNA复制主要是pol 和pol 。第18页课程：生物化学主讲：刘万宏第2节：DNA复制酶学2.3 DNA聚合酶pol Ipol 为含有三种酶活性单一肽链大分子蛋白质，可被特异蛋白酶水解为两个片段，其中大片段保留了两种酶活性,即53聚合酶和35外切酶活性，通常被称为Klenow fragment。323个氨基酸小片段53核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 604个氨基酸木瓜蛋白酶N 端C 端DNA-pol DNA聚合酶活性 35核酸外切酶活性第19页课程：生物化学主讲：刘万宏第2节：DNA复制酶学2.3 DNA聚

10、合酶pol IIDNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 它参加DNA损伤应急状态修复。 pol IIIpol 由十种亚基组成不对称异源二聚体结构，其中亚基含有53聚合酶活性，含有复制DNA功效； 亚基含有35外切酶活性，与DNA复制校正功效相关;亚基是起到滑动夹钳(Sliding clamp)作用，预防聚合酶在单链模板上滑行过程中脱落。功效：是原核生物复制延长中真正起催化作用酶。 第20页课程：生物化学主讲：刘万宏第2节：DNA复制酶学2.3 DNA聚合酶真核细胞DNA聚合酶种类第21页课程：生物化学主讲：刘万宏第2节：DNA复制酶学2.4 DNA连接酶DNA连接酶在复制中起最终接

11、合缺口作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程主要工具酶之一。DNA连接酶催化条件 需一段DNA片段含有3-OH，而另一段DNA片段含有5-Pi基； 未封闭缺口位于双链DNA中，其中有一条链是完整； 需要消耗能量第22页课程：生物化学主讲：刘万宏第2节：DNA复制酶学DNA复制酶学总结DNA复制酶学总结第23页课程：生物化学主讲：刘万宏第3节：DNA复制过程（原核）3.1 复制过程静态描述1.复制起始1）DNA解旋、解链、形成复制叉：拓扑异构酶、解链酶及单链DNA结合蛋白；2）RNA引物合成：依赖于单链模板，由引物酶催化合成一小段RNA引物； 3）特点：原核环形DNA通常只有一个起点，双向复制；真核线性DNA含有多个起点，形成多个复制叉2.复制延长1）子链延长：引物合成后，有pol(真核为DNA或)催化，在引物3-OH末端逐一添加与模板链对应互补脱氧核苷三磷酸。2）半不连续合成：a.领头链：链延长方向与解链方向相同，连续合成；b.随从链：链延长方向与解链方向相反，为不连续合成（产生冈崎片段）3.复制终止1）水解