生化实验室常用缓冲液与pH测定

1、生化实验室常用缓冲液与pH测定 缓冲溶液是一类能够抵制外界加入少量酸和碱的影响，仍能维持pH值基本不变的溶液。该溶液的这种抗pH变化的作用称为缓冲作用。缓冲溶液通常是由一或两种化合物溶于溶剂（即纯水）所得的溶液，溶液内所溶解的溶质（化合物）称之为缓冲剂，调节缓冲剂的配比即可制得不同pH的缓冲液。 缓冲溶液的正确配制和pH值的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极为重要的意义，因为在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH值下进行的，而且受到氢离子浓度的严格调控，能够做到这一点是因为生物体内有完善的天然缓冲系统。生物体内细胞的生长和活动需要一定的pH值，体内pH环境的任何改变都将引起与代谢

2、有关的酸碱电离平衡移动，从而影响生物体内细胞的活性。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同的pH值，此外，各种生化样品的分离纯化和分析鉴定，也必须选用合适的pH值，因此，在生物化学的各种研究工作中和生物技术的各种开发工作中，深刻地了解各种缓冲试剂的性质，准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液，精确地测定溶液的pH值，就是非常重要的基础实验工作。下表列出某些人体体液的pH值： 表13 人体体液pH 体 液 pH 体 液pH 血 清 7.357.45 大肠液8.38.4 成人胃液 0.91.5 泪6.66.9 唾 液 6.37.1 尿4.87.5

3、 胰 液 7.58.0 脑脊液7.357.451.6.1 基本概念 Brnsted-Lowry酸碱理论（又称酸碱质子理论）。1923年由丹麦化学家J.N.Brnsted和英国化学家T.M.Lowry同时提出了酸碱质子学说，发展了酸碱理论，被后人称为酸碱质子理论或Brnsted-Lowry酸碱理论。他们认为凡能释放质子的分子或离子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4 等）称为酸，凡能接受质子的分子或离子（如：H2O，NH3，Cl等）称为碱。因此，一种酸释放质子后即成为碱，称为该酸的共轭碱，同样一种碱与质子结合后，形成对应的酸，称为该碱的共轭酸。 AH B A BH 酸1 碱2 碱1 酸2 酸

4、1 是 碱1的共轭酸， 碱2 是 酸2 的共轭碱。 如盐酸在水中的解离： HCl Cl H+ HCl是酸，Cl是它的共轭碱。 缓冲体系的设计： 强电解质溶于水几乎全部解离为正负离子，弱电解质溶于水时，则不完全解离，只有部分的分子解离出正负离子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸（HA）及其盐溶于水时，只有部分HA解离为 H+ 和 A离子，其平衡方程式如下： K1 HA A H+ (1-1) K2 (1-2) (1-2)式两边取负对数： (1-3) (1-3)式中： HA 为弱酸的浓度 H+ 为HA解离出的氢离子浓度 A 为HA的共轭碱的离子浓度 K1 为酸解离的速度常数 K2 为A与H+ 缔

5、合的速度常数 Ka 为反应方程(1-1)达平衡时HA的解离平衡常数 现将HA的pKa 定义为 lg Ka，将HA溶液的pH定义为 logH+， (1-3)式可写为 ： (1-4) 或： (1-5) 方程(1-4)称为：Henderson-Hassel-Balch方程，此方程对于生物化学学科，在理论与实践上都具有重要意义。该方程表示了溶液pH与溶质中可解离基团pKa之间的关系。很明显，当AHA时： pH pKa这就意味着当HA有一半解离时，溶液的pH等于 pKa，此弱酸碱缓冲体系的pKa即代表缓冲范围的中点。一个缓冲体系的有效缓冲范围，通常是在pKa值为中点的两个pH单位范围内，即：缓冲剂的有效

6、pH范围pKa1，所以，当缓冲溶液的pH等于该缓冲剂的pKa时，缓冲能力最大。若要设计一个新的缓冲体系时，只需按所要求的pH值查出pKa值等于此pH值的各种缓冲剂并从中进行挑选即可。1960年，N.E.Good和他的同事们提出，适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性： pKa值在68之间； 在水中的溶解度高； 不易穿透生物膜； 盐效应小； 离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小； 不与金属离子生成复合物或沉淀； 该缓冲剂化学稳定； 紫外和可见光波长范围内光吸收小； 易制得高纯度的盐。 按照这些要求可以设计和选择最为合适的缓冲剂来配制所需的缓冲溶液。 1.6.2 生物化学常用缓冲液 磷酸盐

7、缓冲液 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽： NaH2PO4： pKa12.12， pKa27.21 Na2HPO4： pKa17.21， pKa212.32 配酸性缓冲液： 用 NaH2PO4，pH14， 配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，pH68， 配碱性缓冲液： 用 Na2HPO4，pH1012。 用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为：容

8、易配制成各种浓度的缓冲液；适用的pH范围宽；pH受温度的影响小；缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。 其缺点为：易与常见的钙Ca+离子、镁Mg+离子以及重金属离子缔合生成沉淀；会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 Tris（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）缓冲液 Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。 Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如： Tris-HCl缓冲

9、液： pH7.58.5 Tris-磷酸盐缓冲液： pH5.09.0 配制常用的缓冲液的方法有两种：按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法；若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液：先称12.11g Tris碱溶于950mL970mL 无离子水中，边搅拌边滴加4N HCl，用pH计测定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水补足到1L。 Tris-HCl缓冲液的优点是： 因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范

10、围pH值的缓冲液；对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。其缺点是：缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1；温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，即：pKa0.031 ，例如：4时缓冲液的pH8.4，则37时的pH7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于04。 易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封。 此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。 有机酸缓冲液 这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH范围为酸性，即pH3.06.0，最

11、常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。 甲酸甲酸盐缓冲液很有用，因其挥发性强，使用后可以用减压法除之。乙酸乙酸钠和柠檬酸柠檬酸钠缓冲体系也使用的较多，柠檬酸有三个pKa值：pKa13.10， pKa24.75， pKa36.40。琥珀酸有二个pKa值：pKa14.18， pKa25.60。 有机酸缓冲液的缺点是：所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反应过程可能发生干扰作用；柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子（Fe3+、Zn+、Mg+等）结合而使缓冲液受到干扰；这类缓冲液易与Ca+离子结合，所以样品中有Ca+离子时，不能用这类缓冲液。 硼酸盐缓冲液 常用的有效pH范围是：pH8.510.

12、0，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。 氨基酸缓冲液 此缓冲液使用的范围宽，可用于pH=2.011.0，例如最常用的有： 甘氨酸HCl缓冲液：pH=2.05.0， 甘氨酸NaOH缓冲液：pH=8.011.0， 甘氨酸Tris缓冲液：pH=8.011.0，（此缓冲液用于广泛使用的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液）， 组氨酸缓冲液：pH=5.56.5， 甘氨酰胺（glycine amide）缓冲液：pH=7.88.8， 甘氨酰甘氨酸（glycylglycine）缓冲液

13、：pH=8.09.0。 此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。其缺点是：与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生物化学反应过程，如代谢过程等。试剂的价格较高。 两性离子缓冲液（Zwitterionic buffers），又称Goods缓冲液1960年，N.E.Good和他的同事们总结了现有的各种缓冲试剂的优缺点后认为，必须用人为设计和人工合成的方法来找到专门用于生命科学研究的特定的缓冲体系，这些缓冲体系应具有前面所述的九条要求和特性。他们合成的一系列Goods缓冲液可查阅有关的资料。Goods缓冲液的主要优点是不参加和不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无抑制

14、作用，所以它们专门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶的研究工作。其缺点是：价格昂贵，对测定蛋白质含量的双缩脲法和Lowry法不适用，因为它们会使空白管的颜色加深。 1.6.3 pH值的测定 测定溶液pH值通常有两种方法，最简便但较粗略的方法是用pH试纸，分为广泛和精密pH试纸两种。广泛pH试纸的变色范围是pH=114、914等，只能粗略确定溶液的pH值。另一种是精密pH试纸，可以较精确地测定溶液的pH值，其变色范围是23个pH单位，例如有pH=1.43.0、0.55.0、5.47.0、7.68.5、8.010.0、9.513.0等许多种，可根据待测溶液的酸、碱性选用某一范围的试纸。

15、测定的方法是将试纸条剪成小块，用镊子夹一小块试纸（不可用手拿，以免污染试纸），用玻璃棒蘸少许溶液与试纸接触，试纸变色后与色阶板对照，估读出所测pH值。切不可将试纸直接放入溶液中，以免污染样品溶液。也可将试纸块放在白色点滴板上观察和估测。试纸要存放在有盖的容器中，以免受到实验室内各种气体的污染。 精确测定溶液pH值要使用pH计，其精确度可达0.005pH单位，关键是要正确选用和校对pH电极。过去是使用两个电极，即玻璃电极和参比电极（甘汞或银氯化银电极），现在它们已淘汰，被两种电极合一的复合电极所代替。 玻璃电极对溶液中的氢离子浓度敏感，其头部为一薄玻璃泡，内装有0.1N HCl，上部由银氯化银电

16、极与铂金丝联结。当玻璃电极浸入样品溶液时，薄玻璃泡内外两侧的电位差取决于溶液的pH，即玻璃电极的电极电位随样品溶液中氢离子浓度（活度）的变化而变化。 参比电极的功能是提供一个恒定的电位，作为测量玻璃电极薄玻璃泡内外两侧电位差的参照。常用的参比电极是甘汞电极（Hg/HgCl）或银氯化银电极（Ag/AgCl）。参比电极电位是氯离子浓度的函数，因而电极内充以4M KCl或饱和KCl，以保持恒定的氯离子浓度和恒定的电极电位。使用饱和KCl是为使电极内沉积有部分KCl结晶，以使KCl的饱和浓度不受温度和湿度的影响。 现在pH测定已都改用玻璃电极与参比电极合一的复合电极，即将它们共同组装在一根玻璃管或塑料

17、管内，下端玻璃泡处有保护罩，使用十分方便，尤其是便于测定少量液体的pH值。 (A) 玻璃电极 (B) 复合电极 (C) 参比电极（银氯化银电极） 测定pH值时，玻璃电极和参比电极同时浸入溶液中，构成一个“全电池”，如下图所示： pH计 Ag/AgCl HCl( 0.1mol/L) 样品 4mol/L KCl或 Ag/AgCl或 溶液 饱和KCl Hg/HgCl 玻璃电极 参比电极 使用时应注意： 经常检查电极内的4mol/L KCl溶液的液面，如液面过低则应补充4mol/L KCl溶液。 玻璃泡极易破碎，使用时必须极为小心。 复合电极长期不用，可浸泡在2mol/L KCl溶液中，平时可浸泡在无

18、离子水或缓冲溶液中，使用时取出，用洗并冲洗玻璃泡部分，然后用吸水纸吸干余水，将电极浸入待测溶液中，稍加搅拌，读数时电极应静止不动，以免数字跳动不稳定。 使用时复合电极的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。 使用前要用标准缓冲液校正电极，其数据见书后附录，常用的三种标准缓冲液是pH=4.00、6.88和9.23（20），精度为0.002pH单位。校正时先将电极放入6.88的标准缓冲液中，用pH计上的“标准”旋钮校正pH读数，然后取出电极洗净，再放入4.00或9.23的标准缓冲液中，用“斜率”旋钮校正pH读数，如此反复多次，直至二点校正正确，再用第三种标准缓冲液检查。标准缓冲液不用时应冷藏。 电极的玻璃泡容易被污染。若测定浓蛋白质溶液的pH值时，玻璃泡表面会覆盖一层蛋白质膜，不易洗净而干扰测定，此时可用0.1mol/L HCl 的1mg/mL胃蛋白酶溶液浸泡过夜。若被油脂污染，可用丙酮浸泡。若电极保存时间过长，校正数值不准时，可将电极放入2mol/L KCl 溶液中，40加热一小时以上，进行电极活化。 pH测定时会有几方面的误差： 钠离子的干扰：多数复合电极对 Na+ 和H+ 都非常敏感，尤其是高pH值的碱性溶液，Na+ 的干扰更加明显。例如，当Na+ 浓度为0.1mol/L时，可使pH值偏低0.4