核酸杂交技术全解

1、核酸杂交技术全解核酸杂交技术全解第1页目 录第一节 核酸分子杂交概念一、核酸探针二、分子杂交信号检测第二节 经典核酸分子杂交技术一、固相杂交二、液相杂交核酸杂交技术全解第2页目 录第四节 影响杂交信号检测原因一、探针选择二、探针标识方法三、探针浓度四、杂交率五、杂交温度六、杂交严格谨性七、杂交反应时间八、杂交促进剂核酸杂交技术全解第3页核酸分子杂交(molecular hybridization of nucleic acid)核酸分子杂交：单链核酸分子在适当条件下，与含有碱基互补序列异源核酸形成双链杂交体过程。核酸分子杂交技术：利用核酸分子杂交检测靶序列一类技术称核酸分子杂交技术。核酸分子杂

2、交技术当前应用广泛，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段有力工具。核酸杂交技术全解第4页第一节 核酸分子杂交概念变性 退火 复性核酸杂交技术全解第5页核酸分子杂交基础原理1、变性（denaturation）定义：在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。 核酸杂交技术全解第6页2、融解温度 (Melting Temperature, Tm)定义：在DNA热变性时，其A260升高达最大值二分之一时温度。影响Tm原因： （1）DNA碱基组成 G-C含量越多 Tm值越高 A-T含量越多 Tm值越低 （2）溶液离子强度 低离子强度 Tm值越低 高离子强度 T

3、m值越高 （3）pH值 pH值5-9 Tm值改变不显著 pH11 不利于氢键形成 （4）变性剂 干扰碱基堆积力和氢键形成核酸杂交技术全解第7页3.复性 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋过程。影响复性速度原因： DNA浓度 DNA片段大小 DNA片段复杂性 适当复性温度 适当离子强度核酸杂交技术全解第8页重点提醒 分子杂交：指含有一定同源序列两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对标准经过退火处理，形成异质双链过程。利用这一原理，就能够使用已知序列单链核酸片段作为探针，去查找各种不一样起源基因组DNA分子中同源基因或同源序列。核酸杂交技术全解第9页一、核酸探针 核酸探针指能

4、与靶核酸序列发生碱基互补杂交，并能由其标识被特异性检测核酸分子。核酸杂交技术全解第10页探针种类寡核苷酸探针基因组DNA探针cDNA探针RNA探针DNA探针（一）常见探针种类核酸杂交技术全解第11页1. DNA探针 最常见核酸探针三大优点： 这类探针大多克隆在质粒载体中，能够无限繁殖，制备方法简便； DNA探针相对不易被降解，普通DNA酶活性能有效地被抑制； DNA探针标识方法较成熟，有各种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、PCR标识法等，能用于放射性核素和非放射性物质标识。 核酸杂交技术全解第12页2.RNA探针优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性杂交较少，未杂交探针可用RNase 降

5、解，降低本底干扰。 缺点：易降解，标识方法复杂 。核酸杂交技术全解第13页3.寡核苷酸探针寡核苷酸探针普通由1750个核苷酸组成。优势：能够区分仅仅一个碱基差异靶序列；缺点：寡核苷酸不如长杂化核酸分子稳定，需优化杂交和洗脱条件以确保寡核苷酸探针杂交特异性。核酸杂交技术全解第14页（二）探针长度1.DNA和RNA探针 DNA探针通常为400500个碱基2. 寡核苷酸探针 探针最小长度取决于其靶序列复杂性核酸杂交技术全解第15页（三）核酸探针标识 1. 探针标识物选择（1）放射性标识（2）非放射性标识依据标识物掺入情况可分为均匀标识和末端标识探针。核酸杂交技术全解第16页不一样标识类型探针比较：

6、优点缺点放射性探针能够准确定量；灵敏度高；本底低；易于除去旧探针,重新杂交新探针短半衰期探针需临用前制备；放射性递减使探针降解；放射性物质对人体有害；费用贵非放射性探针对人体危害小；稳定，可供长时间内连续使用；检测过程快；可同时进行不一样标识探针杂交；本底较低灵敏度不如放射性探针；杂交条件受汇报基团限制；重新杂交新探针比较困难核酸杂交技术全解第17页2.探针标识方法选择 制备探针步骤：探针标识去除未标识核酸探针检测探针标识效率 核酸探针标识方法(1) DNA切口平移标识法(2) DNA随机引物标识法(3) DNA末端标识(7) RNA探针标识(4) cDNA探针标识(5) 寡核苷酸探针标识(6

7、) 单链DNA探针标识核酸杂交技术全解第18页随机引物：含有各种可能排列次序寡核苷酸片段混合物。DNA聚合酶Klenow片段：保留53DNA聚合酶活性,弱35外切酶活性，无53外切酶活性。（1）DNA随机引物标识核酸杂交技术全解第19页5 3 3 5 32P-个别标识单链DNA片段切口原始位置切口最终位置32P-标识DNADNA聚合酶I-32P-dCTP变性DNase I，Mg2+dATP，dGTP，dTTPDNA酶：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3-OH端。大肠杆菌DNA聚合酶：53DNA聚合酶活性；53 外切核酸酶活性。（2）DNA切口平移标识核酸杂交技术全解第20页 条件是有

8、5-OH存在，人工合成寡核苷酸最常见；双链DNA需用碱性磷酸酶切除5-P后再标识5p-HO-CpGpTpA35HO-CpGpTpA3T4噬菌体多核苷酸激酶-32P-ATP532p-O-CpGpTpA337，反应10min, -32P-ATP 需150 ci/反应1) DNA5末端标识碱性磷酸酶(3) DNA末端标识核酸杂交技术全解第21页5335完整双链DNA限制性内切酶5335-32P-dNTP其它3 种dNTPKlenow DNA聚合酶5335变性53355末端突出DNA3末端标识DNA32P-末端标识单链DNA探针2) DNA3末端标识核酸杂交技术全解第22页二、分子杂交信号检测（一）放

9、射性标识探针检测1、放射自显影2、液体闪烁计数法（二）非放射性标识探针杂交检测1、酶促显色检测2、荧光检测3、化学发光检测4、多探针检测核酸杂交技术全解第23页（一）放射性标识探针检测1.放射自显影 放射性杂交检测基于放射性核素释放能量将照片纸感光原理。用32P标识杂交最常见检测方法是放射自显影。核酸杂交技术全解第24页2.液体闪烁计数法 液体闪烁计数法工作原理是被测样品辐射发出辐射能经溶剂分子传递给闪烁剂分子，当被激发闪烁剂分子从激发态退激为稳态时，以荧光光子形式辐射能量，经光电倍增管放大并被测量，就能够实现对放射性核素测定。核酸杂交技术全解第25页（二）非放射性标识探针杂交检测 1.酶促显

10、色检测（1）直接检测酶本身作为标识分子掺入到核酸中去，在洗脱后就可直接进行检测。酶直接作用于显色底物，产生颜色沉淀，显色沉淀可用肉眼检测。酶直接作用于化学发光底物发光, 发光检测要依赖于对蓝光敏感X胶片。这种检测法常见于寡核苷酸探针杂交，这类杂交反应温度低。 核酸杂交技术全解第26页碱性磷酸酶显色反应示意图核酸杂交技术全解第27页HRP酶显色反应示意图(DAB)(TMB)核酸杂交技术全解第28页Dig：半抗原，可经过抗原抗体反应系统与显色体系偶联Dig-DNA探针 + 抗Dig抗体-碱性磷酸酶（或辣根过氧化物酶）+ 底物（2）间接检测 检测含地高辛、荧光素或生物素标识探针时，就要增加一个将酶连

11、接到杂化核酸分子上步骤。核酸杂交技术全解第29页 荧光素：一类能在激发光作用下发射出荧光物质 荧光显微镜观察、免疫组织化学法 2荧光检测 核酸杂交技术全解第30页化学发光是指化学反应中释放能量以光形式发射出来形成检测信号。化学发光酶免疫技术中当前常见酶有碱性磷酸酶及辣根过氧化物酶发射光线强度反应了酶活性，反应了杂化分子量。 3化学发光底物 辣根过氧化物酶催化化学发光反应核酸杂交技术全解第31页采取发色体检测最大益处是可同时检测一个以上杂化分子每种探针分别用不一样汇报基团如生物素、荧光素和地高辛标识并同时与固定在滤膜上核酸杂交采取不一样链霉抗生素或抗体-酶和对应底物组合4多探针检测 核酸杂交技术

12、全解第32页 第二节 经典核酸分子杂交技术核酸杂交技术全解第33页核酸分子杂交分类依据杂交核酸分子种类 DNA与DNA杂交 DNA与RNA杂交 RNA与RNA杂交依据杂交探针标识 同位素杂交 非同位素杂交依据杂交介质 液相杂交 固相杂交 原位杂交菌落杂交Southern印迹杂交Northern印迹杂交点杂交狭缝杂交核酸杂交技术全解第34页分子杂交技术普通过程 探针制备及标识（同位素或非同位素） 待测核酸样品制备（分离，纯化） 杂交（液相，固相，原位杂交） 杂交后处理（去掉非特异杂交分子） 显示结果（显色，发光，放射自显影） 结果分析核酸杂交技术全解第35页固相杂交：先将待测单链核酸样品结合到固

13、相支持物（常见有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，然后与溶液中已知序列标识探针进行杂交，放射自显影分析杂交结果。核酸杂交技术全解第36页（一）反向点杂交反向点杂交（reverse dot blot, RDB）是将各种探针固定在同一膜上，同时参加检测样品DNA又互不干扰， 故能一次性筛查出各种不一样序列。特点：简单、快捷、特异性强、稳定性好较Northern blot省去了电泳和毛细转膜过程核酸杂交技术全解第37页（二）Southern印迹杂交 Southern印迹杂交（Southern blot hybridization/ Southern blotting）是指DNA与DNA分子之

14、间杂交。可用于基因组DNA定性与定量分析，重组质粒和噬菌体分析等。核酸杂交技术全解第38页（二）Southern印迹杂交包含两个主要过程：将待测定核酸分子经过一定方法转移并结合到一定固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）。固定于膜上核酸与同位素标识探针在一定温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。核酸杂交技术全解第39页Southern印迹杂交基础步骤： 待测DNA样品限制性内切酶消化 酶切DNA样品电泳分离 凝胶中DNA变性和Southern转移 探针制备 Southern杂交 杂交结果检测核酸杂交技术全解第40页限制性内切酶消化酶切DNA样品电泳分离凝胶中DNANa

15、OH变性凝胶中DNA分离带Southern印迹凝胶中DNA带被转移到NC膜上标识探针杂交探针杂交带曝光显影核酸杂交技术全解第41页Southern杂交应用 应用单基因遗传病基因诊疗基因点突变检测临床应用用于以下疾病产前诊疗 镰型细胞贫血 苯丙酮酸尿症 珠蛋白合成障碍性贫血 假肥大型肌营养不良 血友病 慢性进行型舞蹈病核酸杂交技术全解第42页（三）Northern印迹杂交Northern 印迹（Northern blot）杂交是应用DNA探针检测特异mRNA另一个膜上印迹技术。此项技术原理和过程与Southern印迹基础相同，只是检测分子是RNA，可用来对组织或细胞中mRNA进行定性或定量分析。

16、核酸杂交技术全解第43页Northern杂交应用 1. RNA病毒检测2. 基因表示检测Northern印迹技术被认为是检测基因表示水平金标准。 核酸杂交技术全解第44页二、液相杂交 液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针与待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子过程。核酸杂交技术全解第45页液相杂交 一个研究最早且操作简便杂交类型。 原理和反应条件与固相杂交基础相同，仅是将待检测核酸样品和杂交探针同时溶于杂交液中进行反应。 液相杂交后过量未杂交探针在溶液中除去较困难，同源与异源DNA分子在杂交过程中会发生竞争，使得杂交结果分析十分困难。 所以液相杂交应用较少核酸杂交技术全解

17、第46页三、原位杂交 应用核酸探针与组织或细胞中核酸按碱基配对标准进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织细胞化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表示检测技术。 核酸杂交技术全解第47页（一）基础操作步骤： 杂交前准备：保持细胞形态结构、保留核酸、增加组织通透性、减低背景。杂交：使探针与细胞中把序列结合。杂交后处理：盐溶液漂洗，以降低背景。显示：依据核酸探针标志物种类选择对应检测系统。 核酸杂交技术全解第48页 （二）原位杂交应用1. 细胞遗传学分析产前诊疗生殖医学中应用血液疾病中染色体易位检测实体瘤研究2. 比较基因组杂交3. 基因图谱绘制4. 病原学检测核酸杂交技术全解第49

18、页荧光原位杂交(FISH, Fluorescence in situ Hybridization)利用荧光标识探针与待测标本核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行区分和计数，从而对染色体或基因异常细胞、组织标本进行检测和诊疗 核酸杂交技术全解第50页核酸分子杂交技术类型 杂交类型检测目标及范围Southern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上DNA分子Northern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上RNA分子反向斑点杂交检测样品中DNA或RNA分子原位杂交检测细胞或组织上DNA或RNA分子核酸杂交技术全解第51页 第四节 影响杂交信号检测原因核酸杂交技术全解第52页 在核酸杂

19、交反应中影响杂交体形成原因较多，主要有探针选择、探针标识方法、探针浓度、杂交率、杂交最适温度、杂交严谨性、杂交反应时间及杂交促进剂等。核酸杂交技术全解第53页一、探针选择在大多数情况下，能够选择克隆DNA或cDNA双链探针。不过在有些情况下，必须选取其它类型探针如寡核苷酸探针和RNA探针。核酸杂交技术全解第54页二、探针标识方法探针标识方法很多，选择什么标识方法主要视个人习惯和可利用条件而定。但在选择标识方法时，还应考虑试验要求，如灵敏度和显示方法等。普通认为放射性探针比非放射性探针灵敏度高。核酸杂交技术全解第55页三、探针浓度随探针浓度增加，杂交率也增加。在较窄范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。探针浓度过低会降低杂交灵敏度，过高又会增加背景染色。普通认为，最正确标准是应用与靶核苷酸探针