曲师大酶工程课件

1、第二章 酶的生物合成与发酵生产第二章 酶的生物合成与发酵生产 提取分离法 微生物细胞发酵产酶 酶的生产方法 生物合成法 植物细胞发酵产酶 化学合成法 动物细胞发酵产酶 Company Logo第二章 酶的生物合成与发酵生产酶生物合成及调节1 细胞的选择及培养基的配制2产酶工艺条件及其调控3产酶的动力学4Company Logo一、酶的生物合成（一）RNA的生物合成-转录(transcription） 定义 以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。（二）蛋白质的生物合成-翻译(translation）定义 以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核

2、糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程Company Logo二、酶生物合成的调节（一）基因调控理论 Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory） 操纵子 基因表达的协同单位 结构基因（编码蛋白质 structural gene S）操纵子 操纵基因（operator gene O） 控制部位 启动子 （promotor gene P）Company Logo 调节基因 启动基因 操纵基因 结构基因 DNA 转录 （-） RNA聚合酶 （+） 转录 翻译 mRNA 翻译 阻遏蛋白 蛋白质 诱导剂 控制区 信息区操纵子基因操纵子调节系统示意图Co

3、mpany Logo调节基因(regulator gene)： 可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物(effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游启动基因（promotor gene）（启动子）： 有两个位点： （1）RNA聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。 只

4、有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。 cAMP-CRP复合物的作用示意图 Company Logo(二) 酶合成调节的类型 1.诱导 (induction) 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。 2.阻遏 (repression) 分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏(feedback repression)Company Logo调节基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白（有活性）基 因 关 闭启动子ORP

5、LacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白（无活性） 基 因 表达mRNAA、乳糖操纵子的结构B、乳糖酶的诱导 乳糖 阻遏蛋白（有活性）诱导Company Logo 色氨酸操纵子酶的阻遏调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达Company Logo酶的诱导和阻遏操纵子模型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因启动基因调节基因结构基因

6、阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达诱导物诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达阻遏蛋白(无活性)酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达代谢产物Company Logo调控方式阻遏蛋白添加物与操纵基因结合阻遏效应举例酶的诱导有活性不转录，继而不翻译诱导物转录，继而翻译乳糖操纵子酶的阻遏无活性阻遏物不转录，继而不翻译色氨酸操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比Company Logo3.分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳

7、源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。Company Logo分解代谢物阻遏现象： 实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。 这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解

8、物基因活化蛋白（CAP）。Company Logo三、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种 (1) 使诱导型变为组成型选育组成型突变株 (2)使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺陷型突变株解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏选育抗分解代谢阻遏突变株 2. 基因工程育种 Company Logo（二）条件控制1. 添加诱导物 酶的底物类似物最有效。2. 降低阻遏物浓度 除去终产物产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富 添加一定量的cAMPCompany Logo第二节 细胞的选择基本原则：1、酶产量高2、容易培养和

9、管理3、产酶稳定性好4、利于酶的分离纯化5、安全可靠现在大多数是微生物发酵生产，动植物细胞占少数Company Logo一、微生物常用的种类： 大肠杆菌（Escherichia coli) 细菌 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis )Company Logo 黑曲霉（Aspergillus niger) 米曲霉 (Aspergillus orzae) 青霉菌 (Penicillium)霉菌 木霉 (Trichoderma) 根霉 (Rhizopus) 毛霉 (Mucor) 红曲霉 (Monascus)Company Logo 产酶微生物的分离和筛选 1)样品的采集:从富含该酶作用

10、底物的场所采集样品 2)富集培养: 投其所好，取其所抗 3)分离获得微生物的纯培养（pure culture）。 4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。 5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。 Company Logo -淀粉酶的筛选Company Logo产酶微生物优良菌种的选育 诱变育种 原生质体融合育种 基因工程育种 Company Logo二、植物细胞 糖苷酶 胡萝卜细胞 半乳糖甘酶 紫苜蓿细胞 漆酶 假挪威槭细胞 过氧化物酶 甜菜细胞 大豆细胞 葡萄糖苷酶 利马豆细胞 酸性转化酶 甜菜细胞 碱性转化酶 甜菜细胞糖化酶 甜菜细胞苯丙氨酸裂合酶 花生细胞 大豆细胞木瓜蛋白酶 番木瓜

11、细胞超氧化物歧化酶 大蒜细胞菠萝蛋白酶 菠萝细胞剑麻蛋白酶 剑麻细胞木瓜 凝乳蛋白酶 番木瓜细胞Company Logo 人黑色素瘤细胞 中国仓鼠卵巢细胞（CHO)动物细胞 小鼠骨髓瘤细胞 牛内皮细胞Company Logo二、 培养基的配制 碳源 氮源 基本组分 无机盐 生长因子Company Logo二、微生物培养基碳源一般为淀粉及水解产物，氮源一般是无机氮源和有机氮源的混合物，无机盐和生长因子则根据需要添加，生产同一种酶，不同的地区、不同的企业中采用的培养基也有所不同，根据具体情况进行选择和优化Company Logo三、植物细胞1、植物细胞培养基特点： (1) 植物细胞的生长和代谢需要

12、大量 的无机盐。 (2) 多种维生素。 (3) 一般无机氮源。 (4) 蔗糖碳源25。Company Logo2.几种常见培养基 MS培养基 B5培养基植物培养基 White培养基 KM-8P培养基Company Logo3.植物细胞培养基配制(1) 大量元素母液(2) 微量元素母液(3) 铁盐母液(4) 微生物母液 (5) 植物激素母液Company Logo四、动物细胞培养基（一）组分1、氨基酸2、维生素3、无机盐4、葡萄糖5、激素6、生长因子Company Logo（二）动物细胞培养基的配制动物细胞培养基组分复杂，首先配制各种母液，一般是过滤除菌，冷冻保藏，使用时稀释。要确保各组分完全溶

13、解，最好是现配现用。Company Logo第三节 产酶工艺条件及其调控保藏细胞细胞活化细胞扩大培养原生质体固定化细胞产酶固定化原生质体预培养无菌空气培养基分离纯化酶Company Logo一、细胞活化与扩大培养 斜面保藏 砂土管保藏保藏方法 真空冷冻干燥保藏 低温保藏 石蜡油保藏培养时温度、pH、溶解氧应为最佳，培养到对数生长期，扩培时接种量为1%10%Company Logo二、pH的调节控制 细菌：pH 6.58.0不同细胞的pH 霉菌和酵母菌：pH 46 植物细胞：pH5.25.8 动物细胞：pH 7.2-7.6需要注意问题：产酶和生长最适pH有所不同，不同pH条件下，同一种细胞所产酶

14、的比例也不同，由于细胞的繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的pH也会发生变化Company Logo调节的方法：1.改变培养基的组分或其比例。2.缓冲液来稳定。3.加入适量的稀酸、稀碱来调节。Company Logo三、温度的调节控制 细菌：3437不同细胞的 真菌：2832 生长温度 植物细胞：2228 动物细胞：3637 注意的问题：最适产酶温度和最适生长温度有所不同，往往低于最适生长温度由于新陈代谢的作用，培养基温度会发生变化Company Logo采用的方法：1.热水升温2.冷水降温设计生物反应器的时候应该有足够的传热面积的热交换器，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等Company Logo四

15、、溶解氧的调节控制溶解氧（soluble oxygen)是指溶解在培养基中的氧气，由于氧气难溶于培养基中，细胞很快就会利用完，因此需要不断得对培养基进行补充。细胞对溶解氧的需要量与细胞呼吸强度以及培养基中细胞浓度密切相关。一般用耗氧速率来表示K o2。Company LogoK o2=Qo2 . CCK o2为耗氧速率，指单位体积（L，mL）培养液在单位时间（h，min）内的耗氧量，（mmol，mL），耗氧速率一般用mmol氧/（h .L）。Qo2为细胞呼吸强度，指单位细胞量（每个细胞，g干细胞）在单位时间（h，min）内的耗氧量，一般以mmol氧/（h . g干细胞）或 mmol氧/（h .

16、 每个细胞）表示。不同的细胞呼吸强度不同，同一种细胞在不同的阶段呼吸强度也不同。CC 为细胞浓度，单位体积培养液中细胞的量，以“g干细胞/L”或者“个细胞/L”表示。溶解氧的供给，一般是将无菌空气通入发酵罐中，培养基中溶解氧的量决定于一定条件下氧气的溶解速度溶氧速率或溶氧系数以Kd表示，单位mmol氧/（h .L）。当Kd K o2时达到平衡。可以满足细胞生长需要Company Logo调节溶解氧的方法：1.调节通气量2.调节氧的分压3.调节气液接触时间4.调剂气液接触面积5.改变培养基的性质溶氧速率和耗氧速率应尽量相等，低于或高于都会对产酶发生不利影响。Company Logo微生物发酵产酶

17、通过预先设计，经过人工操作，利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程，成为酶的发酵生产（fermentation production）Company Logo(一)、微生物发酵产酶的方式和特点1.固体培养发酵。2.液体深层发酵。3.固定化细胞发酵。4.固定化原生质体。特点：种类多、易培养、代谢能力强等。Company Logo(二)微生物酶的类型 1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。 2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，酶活性和浓度受到中间产物和

18、终产物的调控。Company Logo(三)、提高酶产量的措施1.添加诱导物诱导物一般可以分为三类：酶的作用底物、酶的反应产物、酶作用底物类似物2.控制阻遏物的浓度3.添加表面活性剂4.添加产酶促进剂Company Logo植物细胞培养产酶一、植物细胞的特点二、植物细胞的培养特点：1.产率高。2.周期短。3.易于管理，减轻劳动强度。4.产品质量高。Company Logo三、植物细胞培养的工艺条件及其控制1.温度的控制2.pH的控制3.溶解氧的控制4.光照的控制5.前体的添加6.刺激剂的应用Company Logo动物细胞培养产酶一、动物细胞的特性二、动物细胞培养特点1.用于各种功能蛋白的生产

19、。2.生长缓慢。3.为了防止微生物的污染，需要添加抗生素。4.对剪切力敏感。5.大多细胞具有锚地依赖性，适宜采用贴壁培养。6.培养基成分复杂，成本较高。7.原代培养50代后，即会退化死亡，需要重新分离细胞。Company Logo三、动物细胞培养方式1.悬浮培养2.贴壁培养3.固定化细胞培养Company Logo四、动物细胞培养的工艺条件及其控制1.温度控制2.pH控制3.渗透压的控制4.溶解氧的控制Company Logo 植物、动物、微生物细胞的特性比较细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um20030011010100倍增时间/h120.3-615营养要求简单简单复杂光照要求大

20、多数要求不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感非常敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、单克隆抗体、酶等Company Logo第四节 酶发酵动力学发酵动力学（fermentation kinetics)是研究发酵过程中细胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境因素对这些速度影响的学科Company Logo 第四节、产酶动力学 （一） 酶生物合成的模式 根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式，即： 同步合成型 生长偶联型 中期合成型 部分生长偶联型延续合成型 非生长偶联型 滞后合成型Company Logo1. 生长

21、偶联型（又称同步合成型） 酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。 当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。Company Logo生长偶联型中的特殊形式中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。 枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 Company Logo2.部分生长偶联型（又称延续合成型） 酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特

22、点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。 所对应的mRNA相当稳定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线Company Logo3. 非生长偶联型（又称滞后合成型） 只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。 所对应的mRNA稳定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 Company Logo总结：影响酶生物合成模式的主要因素 高：可在细胞停止生长后继 1）mRNA的稳定性 续合成酶 差：随着细胞停止生长而终 止酶的合成 2）培养基中阻遏物的存在 不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。 受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始 合成。Company Logo 酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一