质粒提取及双酶切鉴定

1、质粒提取及双酶切鉴定质粒提取及双酶切鉴定第1页质粒DNA制备、判定内切酶切割重组质粒（p70、p81）质粒提取及双酶切鉴定第2页 一、概述什么是质粒（plasmid）质粒是存在于细菌体内一类独立于染色体能够自主复制双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环超螺旋形式存在。 质粒提取及双酶切鉴定第3页质粒提取及双酶切鉴定第4页 质粒DNA普通特征： 质粒是细菌内共生型遗传因子有相对独立性。它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。质粒提取及双酶切鉴定第5页 质粒DNA与宿主菌染色体DNA两点不一样： 宿主菌染色体(chromosome)DNA通常比质粒DNA

2、要大得多。 纯化分离宿主菌DNA多为线性分子，而质粒DNA呈闭合环形式。 质粒提取及双酶切鉴定第6页 提取质粒DNA目标与意义 是基因克隆(gene clone)第一步（分离得到转运目标基因载体）； 为基因重组(gene recombination)作准备； 质粒能够直接转化(transform)细胞； 为目标基因(target gene)表示提供条件。质粒提取及双酶切鉴定第7页基因载体（gene vector）什么是基因载体 把一个有用目标DNA片断经过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行复制和表示工具基因载体作用为目标基因提供进入受体细胞转移能力为目标基因提供在受体细胞中复制（或整合）和表

3、示所需条件质粒提取及双酶切鉴定第8页基因载体应具备特点: 含有独立复制能力，在细胞中能大量繁殖，从而使目标基因大量扩增 含有适当限制性内切酶识别和切割位点 含有供筛选取遗传标识质粒提取及双酶切鉴定第9页 作为表示载体应能利用宿主酶系统，表示目标基因 相对分子量小 细胞内稳定性高 可转移性 基因载体类型 质粒，噬菌体(phage)，病毒(virus)DNA质粒提取及双酶切鉴定第10页二、质粒DNA提取原理与方法 核酸分离纯化总标准： 确保核酸一级结构(primary structure)完整 排除其它分子污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、外源DNA、RNA等） 质粒提取及双酶切鉴定第1

4、1页 分离纯化质粒DNA方法有很各种： 碱裂解法、煮沸法、high pure plasmid isolation kit等。各种方法原理相同，都是利用两种DNA差异来分离，所以它们有共同步骤： 培养细菌使质粒扩增质粒提取及双酶切鉴定第12页 细菌搜集与裂解 搜集菌液高速离心方法 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、碱裂解法、沸水裂解法、溶菌酶法、超声处理法等。依据质粒大小、宿主菌菌株及裂解后纯化方法等原因综合后加以选择。 质粒提取及双酶切鉴定第13页 质粒DNA纯化 常见方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等。 全部纯化方法都是利用了质粒DNA相 对较小及共价闭合环状性质。 质粒提取及双酶

5、切鉴定第14页 SDS碱裂解法制备质粒DNA原理： 在有EDTA及去污剂（SDS）存在条件下，用碱处理细菌，能够使细菌细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、蛋白质和RNA等），强碱环境（pH12.012.6）能够使细菌线性染色体片段氢键断裂，双链解开变性，而质粒DNA共价闭合环状双链并不完全分离，当加入高浓度酸性盐时，pH值恢复至中性，并在有高盐存在条件下：变性染色体DNA与变性蛋白质以及细胞碎片凝聚成不溶性沉淀物；质粒DNA又恢复天然构型，能溶解在上清液中，这么经过离心能够把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除去。质粒提取及双酶切鉴定第15页 SDS碱裂解法抽提质粒主要试剂 溶液

6、：由葡萄糖、EDTA、TrisCl组成. 葡萄糖作用是增加溶液粘度,减小抽提过程中机械剪切作用,预防破坏质粒。 EDTA 作用是络合镁等二价金属离子,预防DNA 酶对质粒分子降解作用。 TrisCl调整溶菌液维持溶菌作用最适PH范围。质粒提取及双酶切鉴定第16页 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成 SDS作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性； NaOH作用是破坏氢键，使DNA分子变性。 溶液III：由冰醋酸和KAc组成。能中和溶液碱性，使质粒DNA复性，并为染色体DNA缠绕提供盐环境。质粒提取及双酶切鉴定第17页 试验步骤及注意事项： 加1.5ml培养物于EP管，12 0

7、00rpm30sec 弃上清，倒置EP管于卫生纸上使液体流尽。加入100ul溶液I重悬沉淀，猛烈震荡EP管，摇匀。加入200l溶液II，快速温和颠倒数次加入150 l冰凉溶液III，颠倒10s，冰浴4min， 1rpm5min质粒提取及双酶切鉴定第18页 转移上清到新EP管，加入等体积酚/氯仿（1:1）,混匀,1rpm 5min 转移水相至新EP管，加两倍体积无水乙醇，混匀，1rpm5min 弃上清，倒置管于卫生纸上使液体流尽沉淀中加入1ml 70%乙醇， 1rpm5min去上清，静置5min干燥,TE 20 l 溶解质粒，质粒提取及双酶切鉴定第19页注意事项： 1、加样枪正确使用； 2、标识

8、自己所提取质粒类型（pUC119 或 pUC119-U6 ）； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾捅中； 4、加不一样溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、吸收酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到皮肤。质粒提取及双酶切鉴定第20页EcoR、Hind切割重组质粒质粒提取及双酶切鉴定第21页双酶切体系： ddH2O 6l 质粒DNA 10l 10M buffer 2l EcoR 1l Hind 1l 累计 20l 质粒提取及双酶切鉴定第22页单酶切体系： ddH2O 7l 质粒DNA 10l 10M buffer 2l Hind 1l 累计 20l 质粒提取及双酶切

9、鉴定第23页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是识别DNA特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA一类内切酶。质粒提取及双酶切鉴定第24页限制性核酸内切酶存在于细菌体内切割不一样起源DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，含有重大应用价值（“分子手术刀”） 质粒提取及双酶切鉴定第25页作用与甲基化酶共同组成细菌限制修饰系统，限制外源DNA， 保护本身DNA。分类、（基因工程技术中常见型）质粒提取及双酶切鉴定第26页第一个字母取自产生该酶细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发觉先后次序。命名Hin d 属 系 株 序Haemophilus i

10、nfluenzae d株流感嗜血杆菌d株第三种酶质粒提取及双酶切鉴定第27页类酶识别序列特点 回文结构(palindrome)切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG质粒提取及双酶切鉴定第28页Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口质粒提取及双酶切鉴定第29页影响限制酶活性原因1）“星”活性 酶特异性改变或特异性降低而展现活性。 EcoR：GAATTC EcoR*： AATT2）甲基化 识别序列中一些碱基甲基化后会妨碍酶活性。3）底物性状4）试剂：缓冲系统质粒提取及双酶切鉴定第30页三、

11、DNA琼脂糖凝胶电泳 原理 在pH8.0（碱性）环境中DNA磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子电荷数、分子量、构象不一样，它们在经过凝胶立体网格时所受动力和阻力不一样，所以泳动速度有差异，以此到达分离目标。 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）荧光。质粒提取及双酶切鉴定第31页试验步骤： 1、胶带封制胶板两端（示教）； 2、放好梳子，等胶稍稍冷却后灌胶； 3、待胶凝固后撕去胶带，将制胶板放在电泳槽中，轻轻拔掉梳子； 4、加样（10l质粒和2l loading buffer在胶带上混匀）； 5、接通电源，开始电泳（120V）; 6、蓝色条带快到终点时停顿电泳，EB染色5min； 7、漂洗后紫外灯下观察结果。质粒提取及双酶切鉴定第32页注意： 1、灌胶时应防止出现气泡； 2、拔梳子时