病理技术在医学科研中的应用

1、病理技术在医学科研中的应用病理学科是一门基础与临床之间起着桥梁作用的重要学科,病理研究方法在技术工作上又 TOC o 1-5 h z 是多方面的 ,有尸体解剖,大体标本的制作,制片（石腊切片,冰冻切片,半薄切片,超薄切片等）,组织化学方法,免疫酶标技术,荧光技术,摄影技术等.作为实验技术人员大量的工作是病理制片技术, 即常规病理切片,特殊染色,以供教学,科研,临床活检诊断之用 .第一章病理技术的应用范围帮助临床查明死因（原因不明的死亡）手术后病变标本,以明确诊断（临床活检）提供教学,科研的资料第一节 组织制片的概述组织制片技术的应用 ,从 1665年由 HOOk 发现细胞开始 ,已有 300多

2、年的历史.最早应用冰冻切片 ; 随后又进一步利用石蜡的硬度,以石蜡包埋组织,制成石腊切片;后来又利用明胶,火棉胶 ,碳蜡和塑料等物质的韧性,以其包埋组织而制作切片.组织制片技术随着生物学和医学的发展而发展.切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态, 以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化.因此 ,组织制片技术是教学,医学和科研中不可缺少的一个组成部分.第二节 制片的种类1,组织切片法任何组织切片必须依靠切片机将组织切成薄片（厚度以小山计），再进行染色而得到结果.在切成薄片以前必须设法使组织内部渗入足够的支持物质,使组织保持一定的硬度,然后使用切片机进行切片.渗透到组织中的支持剂（物质）有多种,如

3、石腊,明胶,火棉胶和塑料等.冰冻组织切片法是直接利用快速冷冻法进行切片 .2,组织非切片法不用切片机,不经过切片手续而制成组织切片的方法,包括整体封藏法,浮片法 ,压碎法和组织直接印片法.这些方法操作简单而快,可根据制片的需要进行选择使用.第三节 制片方法的程序组织切片法制作过程中的各种操作1,取材与固定取材是根据实验的目的和要求及病变程度而合理取得组织材料.固定是用化学药品把组织原来的结构保存下来,以便观察研究之用 , 固定剂同时具有硬化细胞组织的作用 ,使制片便于进行 .2,洗涤与脱水 TOC o 1-5 h z 洗涤是把渗入组织中的固定剂洗去,防止染色中的结晶产生.脱水是驱除组织中的水分

4、,以利于透明和浸蜡 .3,透明与浸蜡（透蜡）脱水后的组织中水分已被透明可代替,而有利于浸蜡.浸蜡的目的是使组织有一定的硬度而有利于切片和细胞组织保持一定的生活时状态.4,包埋与切片用石蜡和其他包埋剂将组织包绕一定的形状以便于切片 .将包埋好的组织块用切片机切成一定的厚度（以小山计）.5,贴片（展片,捞片）和染色 TOC o 1-5 h z 将已切妥的切片在温水中展平整后用载玻片贴上,稍晾赶后再烤片.染色可使细胞和组织被染上不同的颜色而产生一定的折射率,便于显微镜观察.6,封 片切片染色后用胶类物质将其封固,以利于长期保存.二 , 组织切片的主要程序.标本切开或取厚块-组织固定一固定后处理一（石

5、腊切片法）脱水一透明-浸蜡一包埋一 切片一粘片一脱蜡-各级乙醇-水洗-常规染色或特殊染色-脱水-透明一树胶封片.标本切开或取厚块一组织固定（冰冻切片法）-冰冻切片-粘片一乙醇固定及水洗一常规 染色一脱水-透明一树胶封片.第二章固定 ,固定液和取材第一节 组织固定方法在制作组织切片的过程中 ,首先将组织充分固定后才能进行制片 ,尤其对石蜡切片 ,这是不可少的重要步骤 .1,固定的意义就是使要观察的组织构造尽量接近于它生前的正常状态.2,组织固定的目的1） 迅速防止组织 , 细胞的死后变化,防止自溶与腐败,以保持组织和细胞与正常生活时的形态相似 .2）使细胞内的蛋白质,脂肪,糖 ,酶等各种成分转变

6、成不溶性物质,以保持它原有的结构与生活时相仿 .3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来,而产生不同的折射率,造成光学上的差异, 以便染 TOC o 1-5 h z 色后易于鉴别和观察.固定剂兼有硬化作用 ,使组织硬化增加组织硬义,便于制片.防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构 .6）经过固定的组织,能对染料产生不同的亲和力而着色清晰,便于辩认.由于固定的目的是在于尽量使组织和细胞保持与生活时相仿的成分和形态.因此 , 固定的组织愈新鲜愈好, 固定组织时 ,应使用足量的固定液,其固定液的量一般不少于组织块总体积的 4 倍以上 .3,固定剂的性质 TOC o 1-5 h z 为了能够达到固定的

7、目的 ,必须具备以下的性质:迅速渗入组织而固定原生质,使短期解剖的组织形态不至于有较大变化 .固定液有相当的渗透力,对组织各部分的渗透力相等,可使组织内外完全固定.3）使组织细胞中不至于因固定引起人为的改变.4）在凝固原生质以后,增加细胞对于各种穿透的抵抗力 ,不至于因以后的处理而使固定后的原生质变形.5）尽可能避免使组织膨胀或收缩 .6）能使细胞内的成分（蛋白质） 凝固或沉淀下来.7）增加细胞内含物的折光程度,易于鉴别.增加媒染作用和染色能力.8）使组织变硬,适于制片,但又不使材料太坚硬而松脆 .9）使组织充分固定,便于保存.第二节 介绍几种常见固定液固定剂有简单固定剂（液）和混合固定剂两类

8、.作为较好的固定液,首先有强渗透力 ,能迅速地渗入组织内部 ;其次不会使组织过渡收缩或膨胀,并能使组织内易观察的成分得以凝固为不溶性物质;最后能使组织达到一定硬度,获得较佳的折光率和对某些染料具有较强的亲和力 .一 ,简单（单纯） 固定液1,甲醛 （Formeldehyde）甲醛（福尔马林）为一种无色气体,溶于水成为甲醛水溶液, 甲醛是一种还原剂,极易挥发旦有强烈刺激性气味.在平时常用的甲醛浓度为10%,这是指以10ml 甲醛加入 90ml 的水配成的 ,此液实际上只有4%的甲醛.甲醛水溶液渗透力强 , 固定均匀 ,对组织收缩较少 .但经乙醇脱水时收缩很大,它能使组织硬化并增加组织的弹性. 固

9、定厚度适当的组织,较为适宜. 因早醛为非沉淀性固定剂,它不能使白蛋的及抗蛋白沉淀;但可与蛋白质化合,对脂肪,神经,及髓鞘的固定很好,也可固定高尔基体,线粒体 ,又是复糖的保存剂,使肝糖元变为微细的颗粒团.使用甲醛固定的陈旧组织,以多血的赃器如脾,肝等 ,较易发生黑色或棕黑色的沉淀,称甲醛色素 .2,乙醇 (Ethyl alcohol)乙醇为无色液体,可以水在任何比例下混合.它是一种还原剂,很易被氧化为乙醛,在变为醋 TOC o 1-5 h z 酸,所以不能与铬酸,重铬酸钾,锇酸等氧化剂混合.用于固定时以 80% 95%的浓度为好,它具有固定硬化脱水等多种作用.高浓度乙醇固定的组织硬化显著,组织

10、在高浓度乙醇中留置过久,易变脆 ,也使组织收缩明显 ,均可缩小原组织体积的 20%.因 70%乙醇可较久的保存组织.另外 ,乙醇其渗透力较弱,能沉淀白蛋白,球蛋白和核蛋白.因此,乙醇除固定作用外,还具有硬化和脱水作用 ,所以它在制片过程中用途很大.3,醋酸 (Acetic acid)醋酸又名乙酸,是带有刺激味的无色液体,因在室温15时常结成冰状 冰醋酸 .特性 :(1)在 15时成冰状结晶,有刺激性味,可溶水 ,乙醇一般配成5%作为混合固定液.(2)醋酸只能沉淀核蛋白,对染色质, 固定较好 ,对白蛋白,球蛋白,固定不佳.对脂肪,糖元不能固定.(3)醋酸能使组织膨胀,因此 ,可抵偿因乙醇,升汞

11、,甲醛等固定液引起的组织收缩和硬化,故常配成混合固定液.(4)醋酸穿透速度最快,米粒大的组织在单纯醋酸固定液中 1 2h 即可.5%醋酸的pH 值在2弋戏匕时可停止细菌和酶的活动，可防止组织自溶变性.4,氯化汞 (Mercury bichloride)氯化汞俗称升汞.为白色粉末或针状结晶,有剧毒,必须严格保管及注意使用 .通常用其饱和水溶液,在室温的水中饱和度为5%7%.特性 :（1）能沉淀蛋白质,它不能固定脂肪,类脂和糖类.（2）穿透力较弱 ,单独使用可使组织收缩.因此,多与醋酸和铬盐（重铬酸钾）配成混合固定液组织宜薄而小 2 3 毫米,固定6 18h.（3）升汞混合液固定的组织对于细胞的结

12、构,特别是核的细微结构,显示由为清晰.（4）经升汞固定的组织易产生汞盐的沉着 （为棕黑色结晶 ）易损害切片刀 ,因此染色前必须脱汞.5,苦味酸 （Picric acid）苦味酸是一种黄色结晶 , 是一种相当强的酸. 它在水中的溶解度随室温而变化 , 约在0.91.2%,在空气中能自燃,在密闭器中能剧裂爆炸.为使用安全起见,常制成饱和水溶液贮藏保存 .特性 : TOC o 1-5 h z 1）能沉淀蛋白质,但对脂肪和类脂无固定作用.2）穿透力很慢,细胞收缩显著,但不会使组织硬化 .3）有软化皮肤的作用,配制的Bouin 氏液对头皮及全身皮肤制片效果甚好 .4）苦味酸固定的组织,固定时间太久会影响

13、HE 染色 （苦味酸对碱性染料不易着色）.5）苦味酸酒精饱和液为糖元较好的沉淀剂.6,丙酮丙酮又名醋酮或本酮,极易挥发,易燃的无色液体,能与水,醇,氯仿,醚及多种溶液混合.特性 :1）它可以作固定剂,又可作脱水剂 ,穿透速度快,可使蛋白质沉淀凝固,2毫米以下的组织固定半小时至 1 小时即可 .2）可引起组织较强的收缩使之变硬,对核固定不佳.3）对某些酶的固定很好,如碱性磷酸酶,酸性磷酸酶等.4）丙酮一般多与氯化汞,甲醛混合液使用,先用低浓度丙酮再经高浓度丙酮固定以减少组织收缩和过度硬化 .7,重铬酸钾1）为橙红色结晶,有毒 ,是强氧化剂 ,不能与酒精等还原剂混合,常配成0.5%水溶液固定组织.

14、2）重铬酸钾单独固定组织不能沉淀蛋白质,但加入冰醋酸转变为铬酸,（即酸化重铬酸钾）,可使蛋白质凝固沉淀.3）重络酸钾与甲醛混合（临用时配过久失效）为未酸化的重铬酸钾固定剂,是固定线粒体,高尔基复合体和嗜铬细胞等优良固定剂 ,若配成 Eenker 氏液 ,能很好的固定细胞质,胞核及染色体 .4）重铬酸钾穿透速度快,固定组织收缩很小,但经酒精脱水时都有明显收缩.经重络酸钾固定的组织必须流水充分洗涤（612h）,否则影响染色.5）经重铬酸钾固定的组织 ,对酸性染料,如伊红染色良好,但对碱性料染,如苏木素较差,若加 TOC o 1-5 h z 入升汞及醋酸等,则对细胞核染色极佳.以上叙述了几种单纯固定

15、液的性质和用途,它们各有其优缺点,但单独使用的不多 ,而混合固定液的应用更为广泛.单独固定液如重铬酸钾等单独应用效果不好 ,若与其他固定剂混合就可以成为优良的固定液.二,介绍几种常用的混合固定液1,乙醇 甲醛液 （AF 液）配制:95%或无水乙醇90ml加入40%并装甲醛10ml为常用固定液，取材后立即入此固定液. 此液兼有脱水作用，用于固定肥大细胞和糖元较好，米粒大小固定46h,大块组织1224h, 固定后不经水洗,直接放入95%酒精开始脱水.2,AAF 液配制：纯酒精85ml+醋酸5ml+甲醛10ml3,Zenker 氏液配制:重铭酸钾2.5g+升汞5g+蒸储水100ml加温溶解，冷却过滤

16、，贮于棕色瓶内，成为贮存液.用时取此液临 95ml 再加入冰醋酸5ml 即成 .Zenker 氏液为组织学 ,细胞学,病理学常用的固定液,多用于固定一般组织,能使细胞核和细胞浆染色较为清晰，固定时间1224h然后冲洗24h,切片脱腊后需脱汞（浸入5%碘酒精10）,脱碘（5%硫代硫酸钠）一流水洗.4,Bouin 氏液配制苦味酸饱和液75ml+甲醛25ml+冰醋酸5ml此液渗透快,组织收缩小,固定均匀,此液为常用固定液.它对肝,皮肤 ,胰脏特染效果好,但此液固定过久对碱性染料的着色有影响 .5,Garnay 氏液配制纯酒精60ml+氯仿30ml+醋酸10ml为细胞极好的固定液，对淋巴组织及腺体固定

17、很好，米粒大的组织固定12h,也适宜RNA,DNA及粮元的固定.6,甲醛 生理盐水配制甲醛10ml+生理盐水90ml PH值为7此固定液是应用最广的一种，它可以保护脂类和细胞核.在作酸性染色时，入V-G,或三重染色之前，还可以再使用第2次固定.第三章洗涤 ,脱水 ,透明 ,浸蜡和包埋 ,切片第一节 组织洗涤一,洗涤的目的组织在固定后一定要把渗透到里面的固定液洗去,然后再进行下一步过程.为防止组织中留有较多的固定液而影响脱水剂,甚至可在组织中发生沉淀物或结晶而影响观察,特别是对陈旧性标本更应注意流水冲洗,尽可能减少组织中的酸性程度和甲醛色素.对混合性固定液 ,更应及时洗涤,有利于脱水直至切片和染

18、色.二,洗涤的方法.固定剂以水配制者用流水冲洗,可使组织中的固定液随时溢出和随时洗去.常用的固定剂是甲醛液（10 %甲醛水液 ）,尸检组织 ,大动物组织冲洗时间为 24h 左右 ,小动物组织冲洗时间为 2-10h 左右 . 固定剂含乙醇者 乙醇或乙醇混合液固定液者 ,一般不要求冲洗,如需冲洗必需采用与固 TOC o 1-5 h z 定剂中的乙醇浓度相近的乙醇冲洗,不可用水冲洗,也不应用浓度相差很大的乙醇冲洗,溶液以除去之.三,特殊固定液洗涤法.重铭酸钾 用重铭酸钾固定的组织可用流水冲洗12-24h,或用亚硫酸，或用1 %含水氯溶液进行洗涤.苦味酸含苦味酸固定的组织,可用50 %或 70 %乙醇

19、浸洗.氯化汞用氯化汞固定的组织内常有一种沉淀物生成,呈棱形或不规则或略圆的块状物 ,棱形物被认为氯化亚汞,不规则物可能是金属汞,此种结晶必需洗去,否则会使组织发脆,或染色不良 .第二节组织脱水一,脱水的目的和原则组织经固定和水洗后 ,会有大量水分,而水与苯根本不相融合,所以组织在透明前必须经过脱水这一环节.就是说用某些溶剂逐步将组织块吸收的水分置换出来, 以利于透明剂和石 TOC o 1-5 h z 蜡或火绵胶的渗入,这一过程叫脱水.尸检及活检有条件时,将组织分别进行脱水,如脑 ,胰腺 ,肌肉,胸腺或淋巴结,肝,脾等组织 .因为脱水时间差异性较大,最好是单独处理.动物组织 应区分动物大,小,如

20、狗组织接近新生儿组织,大白鼠和小白鼠也有差异,前者需时稍长 ,后者则较短.脱水时间与脱水剂的关系 脱水剂的 新旧 （纯度 ）影响脱水时间,必须灵活掌握.穿刺组织 如肾穿刺,径胃镜取得组织等,因组织块很小,常规用擦镜纸包裹,防止丢失 .二,脱水剂的种类和效果.非石蜡溶剂的脱水剂 如乙醇和丙酮等,其组织在脱水后必须再经二甲苯透明才能浸蜡.脱水兼石蜡溶剂的脱水剂 如正丁醇等组织在脱水后即可直接浸蜡,不比经过中间溶剂如二甲苯之类的试剂 .脱水种类可根据须要选择,目前在病理诊断和实验性动物研究中 ,较多地采用乙醇脱水,二甲苯透明和石蜡浸透组织.脱水方法甚多 ,最重要的是不应骤然进行,不能操之过急,否则可

21、引起组织强烈收缩,或使组织发生变形,而得不到满意切片.三,常用脱水剂的使用方法1,乙醇 （Alcohol 酒精 ）沸点78.4 ,为最常用的脱水剂 .脱水能力强 ,并能使组织硬化,能较好地与二甲苯透明剂相溶合 .其缺点是易使组织收缩,变脆.导致这些缺点是因为组织在高浓度乙醇（无水乙醇）中停留时间较长 ,或者加温脱水的温度过高.在日常中一般脱水从70%乙醇（人体组织从75%）开始 ,由低向高的梯度脱水.一般的脱水顺序是：75% ,95%，95%，无水乙醇，无水乙醇.只有脱水充分才能在透明剂中透明 .2,丙酮 (Acetone)沸点为56 .脱水作用比乙醇强,但是对组织切的收缩较大,而价格较高 ,

22、故一般少用于组织的脱水 ,主要用于快速脱水或固定兼脱水.脱水时间 1 3h.3,正丁醇 (N-Butyl-alcohol)为无色液体，沸点100118C,微溶于水，在100ml水中能溶8.3g,故脱水能力较弱，但能与水,乙醇及石腊混合,故这种脱水的组织块,可直接浸蜡包埋.这种脱水剂兼透明剂的最大优点是很少引起组织块的收缩及变脆 .第三节 组织透明一,透明的目的在制片过程中有两次透明,第一次是脱水以后组织块的透明,第二次透明是染色以后切片 TOC o 1-5 h z 的透明.组织块透明的目的是便于透蜡包埋,切片透明的月的就是有利光线的透过,便于显微镜下的观察.组织块在浸蜡前 ,必须通过透明以便使

23、石蜡浸入组织内 ,起充分支持硬化组织块的作用 ,以便完整切片 .通常根据透明时间与肉眼观察相结合判断透明程度.二,常用透明剂的种类和使用方法最常用透明剂的种类较多 ,但使用最多的是二甲苯.1,二甲苯易挥发,无色透明液体,长期接触对呼吸粘膜有刺激作用.透明能力强,易使组织收缩,变脆 ,故组织块在二甲苯中宜久留,特别对小动物组织材料必须严格控制好.2,甲苯性质虽同二早苯,但透明较慢,时间比二甲苯长一倍多,也易变脆.有时用以代替二甲苯.苯的用途与二甲苯相似,对组织有较小收缩,是较好的透明剂.但也易挥发,易燃.吸入苯能引起中毒,可以较小使用.4,氯仿即三氯甲烷.其透明能力比二甲苯及苯差，透明时间长达2

24、4h.不易使组织变脆，能溶于醇，醍,苯等,微溶于水,极易挥发 .多用于大块组织的透明 .5,香柏油对组织收缩及硬化程度比任何透明剂小 ,但透明时间长,小块组织至少 12h 以上 ,缺点它不能溶解石腊,透明以后还需二甲苯补充透明.6,松节油 ,汽油可作脱水,又可透明,但需用优质（无杂质）的工业汽油也不行,在条件困难时可试用 .第四节,组织浸蜡（透蜡 ）浸蜡的目的和方法组织经过脱水,透明后要用石蜡,火棉胶,碳蜡等支持剂透入内部,使其变硬并将组织包埋进去以利于切片和观察,这个过程称为 透入 （浸蜡） 或包埋.以石蜡切片的透入即 （浸蜡 ） 为例,其目的就是除去组织中透明剂（如二甲苯等）而代之以石腊,

25、并渗入组织内部,把软组织变为适当硬度的蜡块,以便切成薄片 .浸蜡的方法是将组织经过二甲苯透明以后,并立即投入到液体石蜡中去.在浸蜡时组织必须经过数次纯石蜡（石蜡I , n ,m）,这样可以使石蜡中剩余的透明剂完全除尽，以免影响切片质量 .浸蜡剂的种类 TOC o 1-5 h z 1,石蜡 石蜡有高熔点和低熔点之分,一般普遍应用熔点为56以上的石蜡.低熔点在54以下,用于酶的显示和保存抗原活性.石蜡分软蜡 （52 54）,硬蜡 （56 58）,蜂蜡60 .,气温低时用软蜡.2,火棉胶 目前使用火棉胶透入组织较少 ,用于染色前的覆盖液较多 .3,碳蜡4,明胶第五节 组织包埋石蜡是动物植物,人体组织

26、制片技术中极重要且应用最广的包埋剂.包埋蜡须在温箱内经多次熔化沉淀后的干净蜡 ,包埋较为理想 ,其包埋蜡熔点为56 58.石蜡包埋的注意点 :(1)动作要迅速:特别是冬天,在有多块组织要包埋时,蜡很快会凝固,就包埋不成 . TOC o 1-5 h z (2)切而向下埋:组织包埋要平整或按要求包埋.(3)包埋的镊子必须加温 ,镊子温度又不能太高,否则会烧坏组织.(4)包埋后待蜡块冷却后再放入冷水中 ,不能太快,否则变形有气泡.(5)包埋时组织不能重叠挤压,否则切片不全会影响诊断.(6)包埋用的蜡一般为工业蜡,气候炎热可用熔点高石蜡(60 )第六节组织脱水透明和浸蜡时间各种组织的脱水透明和浸蜡时间

27、表 3-1 尸体解剖组织脱水,透明和浸蜡时间表时间长短均可5 10h5 10h5 10h2 5h2 5h30 min30 min-1h30 min-1h1-2h1-2h2-4h75%乙醇85%乙醇95 %乙醇95 %乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇二甲苯二甲苯二甲苯石蜡 56 58石蜡 56 58石蜡 56 5815678910111213时间分配项目程序表 3-2 动物 （鼠）组织脱水,透明和浸蜡时间表时间长短均可2 5h2 5h2 5h20 min30 min30 min15 min10 min1-2h1-2h75%乙醇85%乙醇95 %乙醇95 %乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇二甲苯二甲苯二甲

28、苯 TOC o 1-5 h z 石蜡56 58石蜡56 58石蜡56 58时间分配项目程序表 3-3 外检组织脱水 ,透明和浸蜡时间表时间长短均可1 2h1 2h1 2h1 2h2h2h1h2h1-2h1-2h2h4h85%乙醇95%乙醇95 %乙醇95 %乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇二甲苯二甲苯二甲苯石蜡 56 58石蜡 56 58石蜡 56 581234567891011时间分配项目程序第七节 组织切片一,石蜡切片法1,切片前的准备工作石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介作用.应先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去组织四周留 2mm 的石蜡边 .在常规实验室中须备以下用品 经过清洁液浸泡过的

29、载玻片 . 展片盆 ,染色架 ,蛋白甘油 . 大 ,中号毛笔 ,眼科镊 （弯）2,切片制作过程 将预先冷却的组织装在切片机固定器上 . 切片组织经过粗切 ,待组织充分切完整 ,右手旋动切片机把,切片带出来之后,用毛笔轻 TOC o 1-5 h z 轻托起,再用眼科镊轻摄蜡片,以正面放入展片盆中,待摊平整后捞片. 捞片在载玻片上的二分之一以处. 切片附贴后,放在空气中稍凉干,即可进行烤片 .3,切片的注意事项 凡是陈旧,腐败或干枯的组织不易制好切片. 固定失时或固定不当的组织 , 染色时常出现核质着色较浅,轮廓不清,出现不等的片状发白区 . 组织脱水,透明和浸蜡过渡,会造成过硬,变脆,特别是动物

30、组织应严格控制. 切片出现横皱纹常多见于组织固定不牢,或切片刀固定不紧. 切片刀不锋利,切片时会自行卷起或皱起,更不能顺利地将切片联结成蜡带.切片刀如有 TOC o 1-5 h z 缺口存在,更易造成切片断裂,破碎 ,不完整等现象. 组织切片机各个零件和螺丝应旋紧 ,否则将会产生震动,以致切片厚薄不均.二,冰冻切片法冰冻切片在组织学技术中应用范围较广 ,对病理学中的临床手术的快速诊断其意义更大.冰冻切片多用于新鲜组织,甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等.组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片 .三,快速石蜡切片_切片脱蜡目的要求:彻底脱去切片组织中的石腊,才能使组织细胞着色,否则成云

31、雾状,会防碍染色细胞结构模糊不清，无法诊断，脱蜡均用二甲苯冬天需加温脱蜡10左右，然后浸入95%至70%AC去二甲苯丙水洗,使切片清亮 .总结组织制片过程收集标本（活检尸检，动物实验一取材固定切块（1 X 1X0.3肆来水冲洗（12h）一组织脱水 （75%A乙醇,85%乙醇,95%乙醇I ,95%乙醇H ,100%乙醇I ,100%乙醇H ,低溶度乙醇2 4h, 高浓度乙醇1h）一组织透明（二甲苯30）-蜡（软,硬蜡,大组织416h）,组织24h,埋 一冷却修蜡块一焊蜡块一切片一贴片一烤片一切片脱蜡一切片染色（常规HF和特染）.第四章染色一,染色的目的任何冰冻切片 ,石蜡切片等如果不经过染色,

32、在显微镜下只能看到细胞及其它组织成分的轮廓 ,即使由于组织内部各种物质的折射指数不同,从光线的明暗上能观察到一些组织结 TOC o 1-5 h z 构 ,但也是极其简单有限的.远不能满足观察和借以诊断的目的.染色的目的 ,是将染料配制成溶液,将组织切片浸入染色剂内 ,经过一定的时间 ,使组织或细胞及其他异常的成分被染上不同深浅的颜色,产生不同的折射率,便于在光学显微镜下进行观察 .因此,染色在组织形态学,特别是病理形态诊断,科研和教学工作中,都具有非常重要的意义和实用价值.二,_ 染色的原理染色就是染色剂和组织细胞相结合的过程.有关两者结合的原理,不同学说 ,尚未完全清楚,而只一般基本认为过程

33、是化学反应和物理现象.一染色的化学反应在组织细胞内 ,一般有酸性和碱性区别 ,酸性物质部分能与溶液中的阳离子结合,碱性物质部分能与溶液中的阴离子结合.在细胞核中 ,特别是核内染色质,一般有酸性物质组成 （其中主要有核酸）,故与碱性染料的亲和力很强 ,易于染色 ,以氧化苏木素微代表的碱性染料中有染色作用的是阳离子.在细胞浆中则由碱性物质组成,所以胞浆与酸性染料有较强的亲和 TOC o 1-5 h z 力 ,以伊红染料为代表的酸性染料中有染色作用的是阴离子.二染色的物理作用毛细作用及渗透作用 组织有许多小孔 ,染料由渗透作用 进入组织,它与组织没有牢固的结合 ,所以是单纯的物理作用 ,不能称为直接

34、染色作用.因所谓染色必需是染料留贮于组织内与组织有较稳固的结合.吸收或溶液作用 组织吸收染料,作牢固的结合,组织的着色与溶液颜色相同,但不是和干燥染料的颜色相同 .如复红溶液为红色,所染组织也为红色,而干燥的复红带绿色.吸附作用 吸附作用是固体物理的特性,它能从周围溶液中吸住一些细小的物质微粒,这些微粒可能是溶于溶液中的化合物 ,也可能是只在溶液中单独存在的离子,如染液中分散的色素粒子进入被染物质的间隙内 ,由于分子的引力作用 ,色素粒子被吸附而染色.三,染色术语的概念(1)普通染色在组织制片技术中 ,常规制片最广泛应用的是苏木精和伊红染色,又称为常规染色 (HE 染色 ).(2)特殊染色特殊

35、染色就是为了显示特定的组织结构或其他的特殊成分,是常规染色的必 TOC o 1-5 h z 要补充,也是染色技术中不可缺少的部分.它在病理诊断中起到辅助作用.(3)单一染色选用一种染料进行的染色,如用铁苏木素染睾丸生精细胞等.(4)复染色用两种不同性质的染料进行染色的方法,如用苏木素和伊红分别使细胞核及胞质染成两种颜色.(5)多种染色 选用两种以上的染料的染色，如Mosson三色染色法(6)进行性,退行性染色进行性染色又称渐进性染色,将组织成分着色自浅至深,当达到所需要的强度时,终止染色 .此种方法称为进行性染色.一般所采用的染液溶度较低,染色过程中应该不时在镜下观察进行控制 ,这样才能得到染

36、色强度适中的效果.退行性染色又称退性染色,先将组织浓染过度,使其超过所需的程度,然后再用某些溶液脱去多余的染色剂 ,以达到适当的深度,并使不应着色的组织 ,细胞的某些成分脱去色度,这个步骤称为分化.而最终使应该着色部分达到适宜程度.如常规 HE 染色中的苏木素染核与盐酸水分化过程就是退行性染色.四 ,染色与分化剂在退行性染色中,需用某些特定的溶液把附着在组织细胞上多余的染色剂脱去,从而使目的物与周围组织形成鲜明的对比,同时使目的物本身的色泽也深浅适当.这种选择地除去多余染色剂的过程,称为分化,所使用的溶液即为分化剂.分化剂分为三类. 酸性分化剂 如盐酸 ,醋酸等,它们能和媒染剂(金属)相结合形

37、成可溶性盐类,从而打开了媒染剂和组织细胞的结合,使组织细胞脱色. 化分化剂 如苦味酸,铬酸,重铬酸钾和过锰酸钾等,属于氧化剂.在染色中经过氧化作用后 ,使染色剂与组织的某种成分的结合更牢固. 染分化剂 媒染剂能促使组织细胞和染色剂相结合.但是将已经过染色的切片再放到媒染剂的溶液中 ,又可使已经和组织相结合的染色剂脱失,这就是媒染剂的另一种功能,称之为媒染分化剂 .五,染色中的注意事项 较多的组织切片染色,是经过固定,脱水 ,透明,包埋,切片 ,脱蜡等步骤以后 ,再进行染色;有的是直接冰冻切片后即可染色,这些都是根据不同的目的要求而进行的染色. 染色准备工作和染色实验室的设置,都是做好染色工作的

38、必要条件.各种器皿的清洗要严格,按染色方法中的细节去做.染色试剂的配制时间长短和存放,一定要按化学性质与组织的着色能力进行正确掌握使用 .实验室常规设置要合理,有条件时 ,可应有通风设备.实验台和实验柜,各种器皿和染色所需物品必须齐全,具有一定的条理性,是开展染色工作和提 TOC o 1-5 h z 高质量的必要条件. 在染色过程中 ,即要按照书本的方法去进行操作,又要根据实际情况进行灵活运用 .在实践中 ,不断地总结经验和教训,才能熟练掌握染色方法和提高实际工作能力. 由于染色方法较多 ,掌握染色种类应多一些 ,对不同的组织选用针对性较强的方法进行染色 ,才能提高染色质量.六,染色中的基本原

39、则一,染色前的处理一 脱蜡至水 凡是石蜡切片必须经过二甲苯脱蜡,各级乙醇至水洗的过程.（切片脱蜡,二甲苯I,II各510 95温醇I II各5 f75%JI 5 V 来洗水冲）二甲苯和各级乙醇必须保持一定纯度,不能混入其他杂质成分,而使染色受到影响.二 除去汞盐沉淀物 对于用升汞固定或含有升汞混合固定液的切片 , 切片脱腊后需脱汞（浸入5%碘酒精10）,脱碘（5%硫代硫酸钠）一流水洗一染色.三 脱甲醛色素 甲醛固定组织时间较长及温度较高情况下 ,甲醛易氧化自行分解产生甲酸导致组织成酸性,此时可能有甲醛色素产生.此种色素无光泽,不溶于水,乙醇 ,二甲苯等.对于这种色素可用下列方法除去.1浓氨水1

40、 ml,75%乙醇200 ml.切片脱蜡后置溶液中30或较久一流水洗一染色.2 1%氢氧化钾1 ml,80%乙醇100 ml.切片脱蜡后置溶液中10 蕊水洗5 -80%醇5 一蒸储水洗一染色.四 除铬沉着物 有些组织用含铬的 Zenker 氏液等固定,致有铬沉淀物.可应用盐酸乙醇溶液 ,或用5%碘酒和5%硫代硫酸钠水溶液处理.二,染色后的处理一染色后的脱水 对于大多数的切片，染色后必需要经过脱水.95%乙醇I , II各5 -100% 乙醇I J各5 .二 染色后的透明 组织经过脱水核透明后会产生一定的折射率,为防止空气中的有色素的细小颗粒沉淀在组织中的不良影响，需加透明处理以使组织切片清晰.

41、二甲苯1,11各5 透 明.三,_ 染色封固剂组织制片需随时检查和保存,故要有盖玻片封固 .通常用中性树胶,此封固剂质量已普遍应用.第五章苏木素 ,伊红染色的应用及其配制,苏木素染色的应用（1）HE 染色在医学领域中的组织学,生物学,病理学及其细胞检查中,是必不可少的最基本染色方法 .（2）在病理诊断（活检 ）,教学 ,科研工作中都被广泛应用,对细胞学的观察也具有重要价值.（3）HE 染色主要显示各种组织正常成份和病变的一般形态结构 ,病理组织学的基本知识大部分都是从观察HE 染色切片中获得的 .二,HE染液的配制.苏木素染液苏木素又称苏木精,为植物染料,是从苏木树树心提炼出来的天然染料（淡黄

42、褐色粉末）,易溶于酒精 ,甘油 ,加热可溶于水.苏木素本身没有染色能力,配制时必须加入含金属的媒染剂（钾明矾 ）,才能达到染色之目的,配制后还需经过氧化成熟产生苏木红才能进行染色（有自然氧化成熟和人工氧化成熟）.配制法有下列几种哈瑞氏（harris）苏木素染液最常应用染色时间为5 10配制蒸馏水 1000ml TOC o 1-5 h z 苏木素35g碘酸钠1g钾明矾5080g水醋酸20ml其优点是 : 配后即可应用染色力较强 .其缺点是 : 极易产生金属膜沉淀.（2）埃利希（Ehrlich）,苏木素染液配制无水乙醇 100ml TOC o 1-5 h z 甘油100ml苏木精2g钾明矾2 3g

43、醋酸5 10ml置于阳光下自然氧化 3 个月左右成熟.其优点是 : 染色结果甚佳,贮存愈久染色愈强,而且不需分色.2.伊红染液苏木素染色后,需用伊红染料作对比染色,伊红着色深浅不一,如胶元纤维粉红色,肌纤维深红色 ,红血球橙色.这样细胞核,细胞桨着色清晰,鲜明 ,便于鉴别.伊红常用配制有两种1）0.5%-1%水溶性伊红乙醇液 伊红y 0.5-1g+95%乙醇25ml+蒸储水75ml+醋酸1一2滴.2）伊红B 0.5g+80%乙酉I 100ml溶解后用石蜡切片染色程序 切片脱蜡,二甲苯I , II各510f无水乙醇5-95双醇I II各5 f75%乙醇5f自来 洗5水冲一10-蒸储水洗一染细胞核

44、（苏木素）35-自来水洗一分化（0.5%盐酸水）一流 水冲307返兰染细胞浆（伊红）1295%乙醇I ,11100%乙醇I , II一二甲苯透明 一封片（中性树胶）一贴号.第六章特殊染色一,特殊染色的概念及意义 TOC o 1-5 h z 特殊染色为常规染色(即苏木素,伊红 )的必要补充,又称选择性染色,只有相对的特异性,如PAS 阴性反应它有糖元.意义 :(1)特染能显示在常规染色切片中不明显的部分,如革兰氏染色,细菌染色.(2) 区别 HE 染色中不能鉴别的组织病变,如 VG 染色区别胶元纤维和平滑肌.(3)显示某些常规染色中不能着色的物质,如网染才能显示网状纤维,常规HE 染色是染不出来

45、的 .因此 ,特殊染色也是制片染色中不可缺少的组成部分,它在病理诊断常着辅助作用,也为科研提供依据.二,学习特染技术应掌握的重点(注意事项 )(1)染色方法的成败,应该在温度,浓度 ,时间和PH 值等方面找原因 .(2)注意特染的应用范围,如某种病变应用什么方法染色才能达到目的,一般先在HE 切片所 TOC o 1-5 h z 见的要求去选择适当的特染方法,一种或多种.(3)必须掌握各种特殊染色的结果,避免导致错误的结论或严重的误诊,如在网染时把胶元纤维误以为网状纤维.(4)尽量要阳性切片作对照,便于选择特染方法,并与 HE 切片作对照 .(5)特染的组织,在其固定,脱水根据要求选择.所用的器

46、皿都必须化学清洗.三,玻璃器皿的清洁在病理实验室可用的玻璃器皿,都必须经过清洗干净才能使用,清洗的方法依玻璃器皿的新旧而不同 .1,新购玻璃器皿的处理对于新购买的玻璃器皿应先用洗衣粉浸泡洗刷,自来水冲洗后再用1 2%盐酸水溶液浸泡数小时后,用自来水冲洗干净,必要时可用少量蒸馏水洗2 次.2,使用后玻璃器皿的处理每次使用后的玻璃器皿都必须及时彻底清洗干净,以供下次实验之用,如轻视这一步骤,可用的玻璃器皿不够干净,则会影响染色效果 ,甚至导致染色失败,特别在酶组化和银离子反应操作过程中更有严格的要求,使用后的玻璃器皿在一般清洗后 ,还要求用硫酸清洗液浸泡.硫酸清洗液配制重铬酸钾 80g自来水100

47、0ml浓硫酸（工业用） 120m新配制的清洁液为红褐色,反复使用一段时间后,慢慢变成绿色,说明清洁液已失败,不能继续使用应重新配制 .3,玻璃器皿的清洗方法任何玻璃器皿都必须用自来水冲洗,然后把残余药液或染液洗去 . TOC o 1-5 h z 用毛刷沾洗衣粉擦干净.自来水冲洗,蒸馏水洗2 次 .把晾干的器皿轻轻置入清洁液浸泡数日 .取出器皿,用自来水把器皿内外彻底冲洗干净,最后用蒸馏水洗2 次.把玻璃器皿倒置于有孔架上自然晾干或温箱中烤干,最后存放橱内备用.四 ,常用的特染一,胶元纤维染色（V G 染色 ）一 胶元纤维的分部组成成分胶原纤维是结缔组织中的三种纤维之一,分布最为广泛,含量最多

48、.主要分布于真皮,腱 ,韧带,骨,透明软骨,动脉 ,肠壁,子宫和基底膜等.胶原纤维具有韧性大,抗拉力强的特点 .胶原纤维 TOC o 1-5 h z 单位主要由纤维母细胞合成.二 胶元纤维染色应用胶原纤维染色在病理诊断上主要用于鉴定梭形,纤维形细胞肿瘤的组织来源;常常要在纤维,平滑肌和神经三者之中作出选择.还能使用于其他的情况下,如观察动脉硬化的心脏,在H E切片中，心肌内散在的小疤痕灶和心肌均被染作红色，而作胶原纤维染色可将胶原组织和上肌明显地区分开来.早期肝硬化用胶原纤维染色,也可使小叶之间少量增生的胶原纤维突出地显示出来.苦味酸 酸性品红法1. VG 染液试剂配制1%酸性品红10ml苦味

49、酸饱和液. 90ml此液常分别配制临用时加以混合,不能久用.【染色步骤】(1)组织固定于10%早醛液中,常规脱水包埋.(2)组织切片脱腊至水 .(3)V G 染液 2 5(酸性品红1:苦味酸饱和液4-6)(4)倾去染液 ,无水酒精急速脱水,用滤纸吸干.(5)二甲苯透明 ,中性树胶封片 .【结果】胶元纤维呈红色,肌纤维 ,胞质及 红细胞黄色.二 , 网状纤维染色一网状纤维染色的形态特点和染色原理网状纤维是网状结缔组织内的一种纤维.它由网状细胞可产生,网状细胞是星状多突的细胞,核大 ,着色较浅 ,核仁明显,胞质较丰实,胞突彼此连接形成细胞网架. 网状纤维细而有分支，穿行于细胞体和突之间，共同构成网

50、状支架.这种纤维用H 染色一般不易辨认.若用银氨溶液浸染能使纤维变成黑色,故又称嗜银纤维 .网状纤维的应用比较广泛,用来判定病变组织支架的破坏情况,组织 ,脏器网状支架的存在 TOC o 1-5 h z 与塌陷 ,完整与破坏,网状纤维的分布及走行,有多少,粗细,疏密或有无断裂形态变化.网状纤维染色的原理网状纤维的染色方法很多 ,但是染色原理基本相同 ,有以下方面.(1)氧化氧化的作用是使网状纤维具有选择性 ,不经氧化的切片 ,网状纤维均不能较好地显示出来 ,常用的氧化剂是高锰酸钾 .(2)漂白一般采用2%草酸,使漂白后无色.(3)媒染作媒染时多用2%硫酸铁氨(俗称铁明矾).这些试剂可增加网状纤

51、维对银氨液的选择性 .(4)浸银也称镀银,且不同的银氨液浸染切片,使银氨配位化合物与网状纤维结合,即带正电荷的二氨合银Ag(NHs)+2 被具有嗜银性物质的网状纤维吸附,时间从数称钟到数分钟.(5)还原甲醛液是还原剂,能把与网状纤维结合的银氨配位化合物网状纤维还原成棕黑色的金属银 .二 网状纤维染色的应用 用于显示和鉴别肿瘤的性质和来源1)显示和区分癌与肉瘤来源于上皮组织的恶性肿瘤(癌 )仅癌巢周围有网状纤维包绕,巢内癌细胞之间则没有网状纤维分部 .来源于间叶组织的恶性肿瘤( 肉瘤),瘤细胞之间往往可见较多的网状纤存在.2) 显示和区分血管内皮瘤与血管外皮瘤恶性血管内皮瘤的瘤细胞主要在嗜银纤维

52、鞘结构以内 ,单个细胞则嗜银纤维包绕;恶性血管内皮瘤的瘤细胞均位于小血管之间网状纤维鞘之外,并有丰富的网状纤维自小血管壁向外呈放射状包绕癌细胞.3)用以鉴别淋巴细胞肉瘤与网状细胞肉瘤等在淋巴细胞肉瘤中产生的网状纤维比在正常淋巴结内的网状纤维鞘为减少 ,网状纤维在瘤细胞间自由行走;而网状细胞肉瘤的网状细胞中会产生较多的网状纤维,与网状细胞紧密粘连,分布于每个细胞之间 . 用于某些肿瘤的诊断根据染色所显示的网状纤维多少,分布及行走特点 , 可用于诊断下列肿瘤 .1) 平滑肌肉 细胞之间见有大量平行分布的网状纤维.2)纤维肉瘤 可见大量网状纤维存在,并且密集包绕细胞.3)滑膜肉瘤 其梭形细胞也产生网

53、状纤维,但不如纤维肉瘤多 . 用于观察和研究癌组织的发生,发展及其恶性程度癌组织发生 ,发展过程以及癌组织生长速度 ,可通过网染进行观察和研究,如癌巢周围的网状纤维包囊完整,说明癌组织生长较慢 ,恶性程度低;再如子宫颈鳞状细胞癌巢周围网状纤维分解,说明癌组织正在扩散,其恶性程度较高. 显示与观察基底膜的变化 上皮样间叶细胞,间皮或滑膜等,可形成细胞巢也可产生少量网状纤维,压迫周围网状纤维,但为断断续续的绝不连成一线,不形成基底膜.显示与观察基底膜的存在与否 ,不但能更有效地判断其上皮来源,而且有助于区分不同来源的上皮肿瘤.如甲状腺髓样癌系假滤泡,无基底膜 ;滤泡癌或正常滤泡有基底膜. 用于坏死

54、组织的结构及类型凝固性坏死用 HE 染色往往为一片红色的无定形物质,识别不出网状纤维支架的形态用显示网状纤维的特殊染色方法,可观察到早期凝固性坏死处的网状纤维支架还保留其特点.肺结核干酪样坏死结核用网状纤维染色后,可以弄清其病变的起源与发展,并可区分结核球的类型,即 肺炎型 , 肉芽肿型 , 阻塞空洞型.肺炎型的坏死组织中尚存在肺泡状排列的网状纤维; 肉芽肿型为大量杂乱排列的网状纤维;阻塞空洞型的内容物则看不到网状纤维. 用于显示和研究肝组织病变 用网状纤维的染色法,观察肝脏病变处的网状支架形态,分布特点及其破坏情况,可以判定和研究其病变性质,程度及其发展与转规.三 网状纤维染色的注意事项用新

55、蒸馏水配制最好用双蒸水配制 .(2)所用玻璃器材及载玻片均要达到化学洁净程度,必要时用粘合剂粘连切片,防止脱片现象.(3)对乙配制好的硝酸银液和氨银溶液,要贮存冰箱中保存待用 . TOC o 1-5 h z (4)在染色过程中 ,用染氨银染液或硝酸银液的前后应用蒸馏水洗浸.(5)氯化金调色和硫代硫酸钠固定的时间不应太长,否则会引起网状纤维染色变淡.(6)根据诊断需要,可进行胞核染色和其其他套色纤维增染,使色彩更为艳丽,清晰 .(7)切片脱水后及时封片,不宜在空气中停留时间过长,以免产生色素颗粒.【 氨银液的配制】取 10%硝酸银水溶液5ml 于三角烧瓶内,一滴一滴地滴加氨水(氢氧化铵),并同时摇动容器,硝酸银遇到氨水立即产生沉淀,当其沉淀物被溶解时(不能完全溶解也可),再加入3%氢氧化钠水溶液5mL溶液重新产生沉淀，此时再滴加氨水.至其沉淀被溶