乙型肝炎标志物检测及质量控制

1、1乙肝血清标志物检测及质量控制关秀茹哈尔滨医科大学附属第一医院检验科 E-mail:guanxiuru0451sohu Tel一页，共九十三页。2主要内容乙型肝炎病毒标志物检测质量控制室间质量评价EQA室内质量控制IQC第二页，共九十三页。3Dane particle小球形颗粒管状和线状颗粒HBV ParticlesElectron micrographHepatitis B Virus 第三页，共九十三页。4 HBV为DNA病毒，球形颗粒，结构包括外壳蛋白HBsAg，前S1、前S2和核心颗粒HBeAg，HBcAg，DNA聚合酶。乙型肝炎病毒标志物检测第四页，共九

2、十三页。5Geographic Distribution of Chronic HBV InfectionHBsAg Prevalence8% - High 2-7% - Intermediate 2% - Low全球约有20亿人曾感染过乙肝其中3.5亿人为慢性HBV感染者每年约有100万人死于HBV感染所致得肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。第五页，共九十三页。6Hepatitis B VirusSources: WHO/CSR/LYO/2002:Hepatitis B CDC 1992年流行病学调查结果我国HBV感染率为：57.6%HBsAg携带者：9.75%, 1.2亿我国慢性乙肝病人：2

3、000万采取措施乙型肝炎疫苗是最有效的防止HBV感染的方式2006年流行病学调查我国1-59岁人群HBsAg携带率为7.18%， 5岁以下儿童的HBsAg仅为0.96%。第六页，共九十三页。7人群HBsAg携带率下降 第七页，共九十三页。8血清标志物检测 经典乙肝“两对半乙肝外表抗原(HBsAg)：最早出现在血液中的病毒抗原乙肝外表抗体抗HBs：中和或保护抗体乙肝e抗原HBeAg：第二个出现在血液中的病毒抗原乙肝e抗体抗HBe乙肝核心抗体抗HBc、抗HBcIgM：最早出现在血液中的抗体IgM乙肝病毒前S1、S2抗原及抗体乙肝病毒大蛋白第八页，共九十三页。9第九页，共九十三页。10HBsAg的发

4、现1964年Blumberg39岁用琼脂扩散法immunodiffusion, ID，从1名澳大利亚土著输血患者血清中发现一种特殊抗原Bull NY Acad Med 1964;40: 377-3861967年Blumberg42岁报告，从Down综合征、白血病和肝炎患者血清中也发现该抗原Ann Int Med 1967;66: 924-931第十页，共九十三页。11HBsAg的发现1970年 Blumberg45岁报告澳大利亚抗原是肝炎病毒1972年正式命名为HBsAg1976年荣获诺贝尔生理学和医学奖51岁2022年逝世，享年86岁Baruch Blumberg第十一页，共九十三页。12

5、HBV感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg，含 量在5ng600g/ml之间。最低含量为0.2 ng/ml以下， 高者可达2000g/ml以上。 HBV的前S/S基因编码HBsAg，构成病毒外膜，根据所 带亚型决定簇的不同分为adw、adr、ayw和ayr。我国绝 大多数地区以adr为主，adw次之 。 HBsAg不仅存在于血液中，而且还存在于许多体液和 分泌物中，如唾液、尿液、乳汁、精液等。乙肝病毒外表抗原 HBsAg 第十二页，共九十三页。13鉴别乙型肝炎与其他病毒性肝炎病毒性肝炎HBsAg阴性HBsAg阳性其他病毒性肝炎乙型肝炎乙肝病毒外表抗原的应用第十三页，共九十三页。14鉴别

6、急性与慢性HBV感染急性乙型肝炎感染6个月第十五页，共九十三页。16HBsAg 检测方法进展定性定性定性定量70年代80年代90年代2000年以后 琼脂扩散 反向血凝 时间分辨 对流免疫电泳 放射免疫 酶联免疫 或化学发光第十六页，共九十三页。17免疫耐受期免疫清除期（活动期）非活动或低（非）复制期再活动期不需要治疗需要治疗不需要治疗需要治疗HBV自然感染史第十七页，共九十三页。18 感染乙肝病毒2-11周后血清开始出现HBsAg，之后出现转氨酶异常和临床病症。1HBsAg定性检测阳性：见于急性乙肝患者，慢性乙肝患者，无病症乙肝病毒携带者。HBsAg的临床意义第十八页，共九十三页。192 HB

7、sAg定量检测-老指标新意义 参考值：0-0.05IU/mL 临床意义：可作为HBV携带者乙肝病毒复制的参考指标评价拉美呋定的治疗效果监测应用-干扰素治疗病人的乙肝病毒复制确定肝移植病人免疫球蛋白的使用剂量对患者的应答情况进行预测对接受治疗患者的免疫控制 HBsAg 转阴结局进行预测。第十九页，共九十三页。20HBsAg定量检测的临床应用-作为HBV携带者乙肝病毒复制的参考指标HBeAg 是反映病毒复制的指标, 并且HBeAg转阴通常是预示着HBV DNA水平降低到低于105 copies/ml的标志。然而，一局部HBeAg阴性但是HBV DNA仍然保持较高的滴度(106copies/ml)。

8、HBsAg and HBV DNA 水平有较高的显著性相关.作为一种替代检测，HBsAg的定量检测能够准确地预测HBV的复制。HBsAg高于15000IU/ml可能反响HBV DNA处于较高水平的滴度以及HBeAg处于阳性的状态。如果HBsAg 滴度在1600 至15000IU/ml之间，应该考虑检测HBV DNA。第二十页，共九十三页。21HBsAg定量检测的临床应用-评价拉美呋定的治疗效果当出现YMDD 突变出现的时候, 通常在生化指标出现异常之前血清HBsAg 浓度和HBV DNA滴度增加。在YMDD突变出现之后，血清 HBV DNA 持续升高, 然而HBsAg的增加是瞬时的, 与ALT

9、的升高相似。(A)在大局部病人中, 血清HBsAg的增加是由于HBVDNA的增加. 然而在某些病人中, 血清HBsAg在HBV DNA增加几个月之前便增加。 (B). 除了监测HBV DNA 水平之外，同时监测血清HBsAg浓度或许能够有利于较早地发现在拉美呋定治疗中的耐药突变。第二十一页，共九十三页。22HBsAg定量检测的临床应用-监测应用a-干扰素治疗病人的乙肝病毒复制 量化评估乙肝病毒外表抗原的出现是大有应用前景的，因为该方法是一简单而廉价的方法，可以用于慢性乙型肝炎患者接受干扰素治疗时监测病毒复制的指标。第二十二页，共九十三页。23乙肝病人肝移植后使用乙肝免疫球蛋白可以有效地防止再感

10、染的发生。HBsAg降低至1IU/ml以下时，HBsAg和HBIG的呈高度相关r=0.97,r=1.00；Anti-HBs升高至大于1000IU/L时， HBsAg和HBIG的呈高度相关r=0.94,r=1.00。在移植期间，用于降低HBsAg 增加anti-HBs 的HBIG 的剂量取决于HBsAg的水平而不是HBV DNA 水平。HBsAg定量检测的临床应用-确定肝移植病人免疫球蛋白的使用剂量第二十三页，共九十三页。24对患者的应答情况进行预测 2022年，Sonneveld等研究结果说明： HBeAg+患者，用干扰素治疗12周时HBsAg未下降的患者中97%为无应答，且最终无一例获得HB

11、sAg转阴。因此认为治疗12周时HBsAg无下降的患者获得持续病毒应答SVR的几率非常小，同时不大有HBsAg转阴的时机，所以临床医生可以根据12周时患者的HBsAg降低情况来决定是否继续接受治疗。第二十四页，共九十三页。25对患者的应答情况进行预测干扰素治疗HBeAg+ 乙肝患者12周时HBsAg水平是今后HBsAg去除的预测指标治疗12周时HBsAg无下降20000IU/ML可预测低应答，可作为停药规那么。治疗过程中HBsAg无下降，复发率高。治疗12周时HBsAg明显下降20000IU/ML可预测高应答，治疗效果较好，继续用药，完成疗程。第二十五页，共九十三页。26对患者的应答情况进行预

12、测干扰素治疗HBeAg- 慢性乙肝患者，12周时无HBsAg下降、HBV-DNA下降2Log cp/mL，可作为停药指标治疗12周时HBsAg下降 1500IU/mL ， HBV-DNA下降1Log1年内下降，3年时HBsAg消失在25%。缓慢下降HBsAg1Log1年内下降，3年时HBsAg消失在1.4%。稳定，无变化，3年时HBsAg消失在0%。HBsAg消失患者的HBsAg 呈快速和持续下降。第二十七页，共九十三页。28对接受治疗患者的免疫控制 HBsAg 转阴结局进行预测2022年Heathcote等研究结果说明，与所有患者的总体水平相比，发生HBsAg转阴患者的HBsAg水平在治疗期

13、间明显下降，而HBV DNA水平那么无明显差异。这说明通过HBsAg定量检测提前预测患者获得免疫去除的可能性，从而提高患者的治疗信心和疗效。Wursthorn等在2022年研究结果显示，口服抗病毒治疗中，HBsAg的水平下降尤其是迅速下降与HBsAg去除密切相关，认为HBsAg去除的患者可以考虑停止治疗。第二十八页，共九十三页。29HBsAg去除和血清学转换是理想的治疗终点持久免疫控制是到达HBsAg去除的重要条件HBsAg下降HBVDNA抑制治疗中持久免疫控制HBsAg去除减少肝硬化和肝癌，提高存活率第二十九页，共九十三页。30HBsAg去除和血清学转换是理想的治疗终点HBsAg血清转换可作

14、为持久免疫控制指标即使使用高敏度试剂测不到HBVDNA并不表示无循环的HBV和/或HBV感染已去除时点评价病毒载量可作为抗病毒治疗有效和持续应答HBsAg定量检测可确定宿主免疫系统是否已有效控制HBV感染第三十页，共九十三页。31HBsAg检测在个体化卫生保健中的作用健康无症状疾病有症状疾病慢性疾病或治愈危险性评价筛查诊断预后评价治疗应答预测监测发生疾病倾向早检测预测可能的病情预测对治疗的可能应答检测治疗效果/疾病复发第三十一页，共九十三页。32HBsAg测定中可能存在的挑战：假阴性HBsAg含量低于所用方法的测定下限之下。如感染的“窗口期、急性期后或恢复期、自限性感染末期的携带者等编码HBs

15、Ag的HBV-S基因的突变HCV/HDV重叠感染对HBV复制和/或HBsAg的表达的抑制作用 测定方法所用抗体对HBV不同基因型检测敏感性的不同钩状效应HOOK EFFECT第三十二页，共九十三页。33HBsAg的变异所致的不常见的HBV标志物模式或不一致的结果单独抗HBc阳性。HBsAg阴性但HBeAg阳性。HBsAgHBeAg和抗HBs大多为100PEI U/mL，那么建议调整治疗方案。第四十二页，共九十三页。43HBV 变异的检测 HBV 突变的原因乙肝病毒的复制是通过用逆转录酶RT由RNA到DNA，由于逆转录酶缺乏必要的校正能力。逃避机体去除病毒的压力。第四十三页，共九十三页。44HB

16、sAg突变定义：HBsAg的突变是乙肝病毒的外表抗原蛋白的决定簇的结构改变，这个结构的改变是由病毒核酸和氨基酸序列出现的替代，删除或插入性的变化所引起。位置: 报道中最常见的变异位于“a决定簇即有双环结构的乙肝病毒S基因的124147a.a.报道中最常见的变异株是 Gly甘氨酸145Arg精氨酸。原理 :“a决定簇具有很强的抗原性，所以是中和抗体的诱导位和作用靶位，在这个区域的发生变异可以逃逸宿主产生的中和性抗体的中和作用。第四十四页，共九十三页。45HBsAg逃逸突变的影响逃避宿主的中和作用，导致HBV突破性感染。在有HBsAg变异株检测能力的测试中发现HBsAg和anti-HBs共存。在无

17、HBsAg变异株检测能力的测试中出现假阴性结果，可能在临床诊断和血液筛查中造成严重后果。乙肝疫苗接种加速了HBsAg的突变，乙肝的免疫治疗和抗病毒治疗也会导致HBsAg的突变。第四十五页，共九十三页。46常见乙肝病毒标志物检测模式HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb 病程-未感染+-+-急性感染初期+-+-+急性或慢性乙型肝炎，高传染性（大三阳）+-+急性、慢性乙型肝炎或HBsAg携带者+-+急性乙肝趋向恢复或慢性乙肝，弱传染性（小三阳）第四十六页，共九十三页。47HBsAgHBsAb HBeAg HBeAb HBcAb 病 程-+急性HBV感染“核心窗口期”或既往曾感染

18、过乙肝，有流行病学意义 -+乙肝恢复期，弱传染性-+-+急性乙肝康复期，开始产生免疫力-+-+急性HBV感染康复期或有既往感染史，目前保持免疫力-+-疫苗接种后或HBV感染后康复常见乙肝病毒标志物检测模式第四十七页，共九十三页。48结果的报告与解释结果解释的责任属于临床实验室，应根据所检测的人群解释结果。临床解释的责任属于临床医生，其应根据临床信息解释结果。临床实验室与临床医生的对话对适当利用实验室数据非常重要。第四十八页，共九十三页。49乙肝“两对半结果解释的困扰HBsAg和抗-HBs同时出现HBeAg和抗-HBe同时出现HBeAg阳性但HBsAg阴性只有抗-HBe和抗-HBc阳性单项抗-H

19、Be阳性单项抗-HBc阳性第四十九页，共九十三页。50单独HBsAg阳性出现特点可能的解释实验室检测原因高流行地区：70%HBsAg单独阳性是假阳性结果低流行地区：50%的少见的HBV血清学模式为HBsAg单独阳性(1) HBV急性感染早期(2)HBV疫苗接种后的抗原血症 (3)由于机体对HBcAg免疫耐受、感染有缺陷的HBV病毒株导致机体不产生HBsAg假阳性结果第五十页，共九十三页。51HBsAg和抗-HBs同时阳性出现特点可能的解释实验室检测原因可出现于无症状携带者、急慢性和隐匿性感染者 ，发生率在5%-30%不等（1）pre-S基因、S基因的突变，使得突变型HBsAg和针对野生型HBs

20、Ag的抗体同时存在（2）产生亚型特异的HBsAb。（3）新的HBV病毒株感染（4）HBV隐匿性感染中，免疫抑制下HBV复发感染（1）HBsAg假阳性结果（2）HBsAb假阳性少见。第五十一页，共九十三页。52单独HBcAb阳性出现特点可能的解释实验室检测原因低流行地区：献血员人群的发生率为1%HBV流行地区：献血员人群的发生率为20%可见于HBV急性感染恢复的“窗口期”、HBV感染恢复多年以后或慢性HBV感染。慢性HBV感染中单独HBcAb阳性可能是：（1）隐匿性感染：血清中HBsAg阴性、血清或组织中HBV DNA阳性，HBV其它血清学标志物可以是阳性也可以是阴性。例如合并感染其他肝炎病毒可

21、造成隐匿性感染。 （2）形成HBsAg-HBsAb免疫复合物（1）HBcAb假阳性（2）HBsAg变异导致假阴性结果（3）抗-HBs浓度低于检测限。第五十二页，共九十三页。53HBeAg和HBeAb同时阳性出现特点可能的解释实验室检测原因HBeAg和HBeAb同时阳性抗原抗体转换过程中HBeAg浓度过高导致的HBeAb假阳性：竞争法检测HBeAb时，样本中的HBeAg的量足以同时结合酶标板上的HBeAb和游离的酶结合物，使得酶结合物不能与结合于固相上的HBeAg相结合，造成不显色的结果，导致HBeAb假阳性。第五十三页，共九十三页。54单独HBeAg阳性出现特点可能的解释实验室检测原因单独HB

22、eAg阳性HBeAg阳性的孕妇，可通过胎盘将HBeAg传给胎儿，造成新生儿HBeAg单独阳性。（1）HBsAg变异导致HBsAg假阴性结果；（2）HBeAg假阳性。第五十四页，共九十三页。55单独HBeAb阳性出现特点可能的解释实验室检测原因单独HBeAb阳性无（1）HBsAg变异导致HBsAg假阴性结果；（2）HBeAb假阳性第五十五页，共九十三页。56如何正确地理解和应用乙肝血清学标志物检测结果：临床实验室方面应在充分阅读理解试剂盒说明书的根底上，建立检测报告的标准操作程序SOP。与相应的临床科室医生充分交流沟通，使得临床医生能充分理解结果的报告方式及内在含义，以及在标本采集、患者用药上可

23、能对检验结果的影响，从而尽可能防止标本收集环节可能给结果带来的影响。可能的话，在结果报告单上加上对结果的综合解释。第五十六页，共九十三页。57如何正确地理解和应用乙肝血清学标志物检测结果：临床医生方面根据检验目的，正确地开出检验申请单。 最重要的是要明确检测乙肝“两对半的目的！是诊断是否感染？还是抗病毒治疗预后判断？对检验结果不应是固定的静止的去看待，应以动态的纵向的和横向的方式去看。 作为一个特定的HBV感染者，某一次检测乙肝“两对半，什么样的模式组合都有可能出现。出现某种罕见模式，既可能是由于患者感染后的免疫状态的反映，也可能是标本中的干扰因素所致的假阳性或假阴性，或实验室不可知原因的检测

24、错误。第五十七页，共九十三页。58 质量控制的目的： 给临床和患者提供准确的检测结果，进而为疾病的诊断提供有利依据。质量控制第五十八页，共九十三页。59质量管理概览QM分析前分析中分析后样本采集样本前处理样本运输仪器状态QC样本保存报告发放临床沟通CQI维护保养试剂管理耗材管理人员管理定标、校准定标验证室内质控室间质控方法学验证QA投诉处理第五十九页，共九十三页。60质控目的的新理解标准所有人：主任操作者病人临床厂家很大程度上，质控的目的是为了失控第六十页，共九十三页。61质控品精密度评价室内质控(精密度控制)质控品定标(正确度控制)定标液（校准品）标准品（标准物质）正(准)确度评价室间质评比

25、对方案第六十一页，共九十三页。62 室间质量评价实验室间比对： 使检验结果具有可比性，保证检验结果的准确性。 如参加卫生部临检中心及省临检中心的室间质评。 室内质量控制： 使检验结果具有很好的重复性，决定当日结果能 否发出。质量控制第六十二页，共九十三页。63室间质评： 如参加卫生部临检中心及省临检中心的室间质评。室内质控： 1、原厂质控品 2、第三方质控品：从卫生部临检中心及省临检中心购置；商品化质控品 3、自制：利用试剂盒内的阴阳性对照或患者的血清进行配置 质控品来源第六十三页，共九十三页。64定性、半定量与定量工程的质量控制定性试验：报告“阴性-或者“阳性+的试验。半定量试验：报告“x+

26、、“阴性-或者“滴度的试验。定量试验：报告定量检测工程的试验。质量控制第六十四页，共九十三页。65常见定性、半定量及定量试验的检测报告方式定性检测肉眼判读结果，无法需读取检测信号大小强弱，直接报告阴阳性的。如：ENA抗体、金标法工程、免疫印迹法工程。仪器判读连续检测信号，使用Cut-off判断阴阳性的。如：ELISA、发光仪等。半定量检测肉眼或者仪器判读，判别颜色强弱并报告“x+或报告稀释度的。如：尿干化学、凝集试验。定量检测第六十五页，共九十三页。66定性、半定量及定量工程的质控方法定性检测：直接报告阴阳性的注意“质控品与“阴阳性对照的区别。需要阴性和阳性质控各一。最好有弱阳性质控。无法统计

27、质量控制，但须回忆性统计符合率。定性检测：以Cut-off值报告阴阳性结果的。用阴性质控、弱阳性质控如不可取得，只用阳性质控来控制。夹心法弱阳性质控的S/CO约为1.5-4，视不同方法而定，如竞争法：S/CO约为0.5-0.9。用“符合度判断质控情况。用L-J图控制精密度：定性sAg、sAb、eAg CV%15%左右。eAb、cAb CV%20% 定量sAg 、sAb10%第六十六页，共九十三页。67定性、半定量及定量工程的质控方法半定量检测：报告“x+或稀释度的选择阴性和适中浓度质控品。如2+。1+3+为在控。无法统计质量控制，但须回忆性统计各结果比率。定量检测使用定量质控方法第六十七页，共

28、九十三页。68定性工程质控还因注意的几个问题质控判断和精密度控制分开。推荐用S/CO值建立均值、SD、CV%。因为有些读数值很低的工程是不符合相应统计要求的。如过低值的CV%会很大。加心法使用弱阳性和阳性统计。竞争法用阴性和弱阳性统计。避开极低的S/CO。最好附加极高值质控排除钩状效应。第六十八页，共九十三页。69乙肝标志物质量控制主要包括三个方面：1测定前的质量控制；2统计学质量控制；3质量控制的评价。第六十九页，共九十三页。70测定前的质量控制实验室设施、仪器设备及管理理想的试剂和操作方法 人员培训 第七十页，共九十三页。71实验室设施、仪器设备及管理实验室空间及工作流程的设计实验室环境条

29、件的控制：温湿度控制设备、稳压或不间断电源仪器设备及管理：酶标仪、洗板机、全自动免疫分析仪、加样器等应建立技术档案，并定期维护和校准第七十一页，共九十三页。72理想的试剂试剂的质检(确认) 测定下限(Detection limit) 批内变异(10%)和批间变异(15-20%) “钩状效应(Hook effect) 变异体的检测能力(HBsAg) 对本室所用室内质控血清检测的一致性第七十二页，共九十三页。73理想的操作方法按照试剂盒说明书操作即可吗?操作中影响测定结果的关键环节写出具有可操作性的SOP第七十三页，共九十三页。74人员培训培训所涉及的范围:仪器设备使用、维护和校准；试剂、方法原理

30、；质量管理体系；相关法律法规、相关领域的新技术、新理念和新进展；实验操作技能等。如何培训：讲座、讨论、自学和参加培训班等。培训的评估：书面考试、实验考核、讨论心得、论文、综述等。对培训者的评估：培训者的背景、资历、在相关领域内的成就、所接受过的相关领域外部培训情况等。第七十四页，共九十三页。75统计质控方法定性免疫测定质控物浓度的选择室内质控物的质检(确认)每块板质控物的数量质控规那么Levey-Jennings质控图方法 第七十五页，共九十三页。76定性免疫测定质控物浓度的选择可选择S/CO值减去精密度测定中得到的三倍批间CV通常的ELISA测定批间变异CV%在15%左右与该S/CO值的乘积

31、意即三倍SD仍大于1的质控血清作监测重复性的室内质控用 计算公式：S/CO1-3CV%=S/CO-3SD S/CO比值可在1.54之间。 同时选择S/CO处于1.01.5左右的质控血清以判断每次测定时试剂盒测定下限的有效性。第七十六页，共九十三页。77室内质控物的质检(确认)使用前的质检：检测的S/CO比值是否适宜、与前一批质控物的S/CO比值的比较使用中确实认：质控物的稳定性、批与批质控物的一致性第七十七页，共九十三页。78每块板质控物的数量及位置空白2份弱阳性质控23份阴性质控23份阳性质控随机放置于血液标本中间第七十八页，共九十三页。79质控规那么的表达方式及定义 质控规那么的表达方式

32、质控规那么的功能 常用质控规那么的符号及定义 第七十九页，共九十三页。80质控规那么的表达方式通常质控规那么以符号AL来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均值或均值1-3SD来表示。 当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。 常用的13S质控规那么，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批测定判为失控。 第八十页，共九十三页。81质控规那么的功能 简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控。第八十一页，共九十三页。82常用质控规那么的符号及定义 符 号 定 义12S 一个质控测定值超出2s控制限。13S 一个质控测定值超出3s控制限。22S 两个连续的质控测定值同时超出+2s或2s控制限