医学微生物学：第3章 临床微生物学检验技术

1、第三章 临床微生物检验与技术1主 要 内 容细菌形态学检查：不染色/染色细菌分离培养和鉴定细菌的非培养检测方法2一 细菌形态学检查染色检查不染色检查3不染色标本检查应用：检查生活状态下细菌的动力及运动状况方法：压滴法、悬滴法、暗视野显微镜检查4不染色标本检查-压滴法载玻片细菌悬液盖玻片高倍镜或者暗视野观察5不染色标本检查-动力观察动力(+)：明显的方向性位移动力(-)：呈现布朗运动，原地颤动制动试验(+)：霍乱弧菌6染色标本的检查-常用染料碱性染料 酸性染料 脂溶性染料 复合染料（中性染料）荧光染料 7染色标本的检查-常用染色方法革兰染色抗酸染色荧光染色鞭毛染色荚膜染色特殊染色：墨汁染色、异染

2、颗粒、芽孢染色8（一）革兰染色原理 细胞壁成分和结构不同 G菌： 厚，紧密G菌： 薄，交联松散，脂含量高9（一）革兰氏染色原理等电点学说：革兰氏阳性菌的等电点比阴性菌（PH4-5）低阳性菌与碱性染料的结合力比阴性菌强化学学说：阳性菌：碘液与结晶紫结合+菌体内核糖核酸镁盐-蛋白质复合物革兰氏阴性菌缺乏核糖核酸镁盐渗透学说乙醇使阳性菌所含粘肽多糖脱水而致细胞壁间隙缩小10（一）革兰染色步骤 1.初染：结晶紫 紫色2.媒染：碘和结晶紫形成脂溶性大分子复合物，被细胞壁“锁”在细胞内 紫色3.脱色：酒精 紫色/无色4.复染：沙黄复染 紫色/红色11（二）革兰染色临床意义鉴别细菌研究细菌致病性有助于指导临

3、床用药12细菌的形态、染色性的特征阳性球菌（GC）阴性杆菌G-B真菌孢子（二）革兰染色临床意义（二）抗酸染色 原理：细胞壁内含大量脂质加热和延长染色时间促着色结合后，不易脱色（3%盐酸酒精）14步骤： 涂片固定 酸性复红初染 3%盐酸酒精脱色 美蓝复染 镜检(红色）结果: 抗酸菌红色 非抗酸菌蓝色（二）抗酸染色15步骤： 涂片固定 金胺O染色 盐酸酒精脱色 复染 镜检结果: 抗酸菌 明亮橘黄色 非抗酸菌-无荧光 （三）荧光染色16（四）鞭毛染色 原理：鞭毛被碱性复红酒精饱和溶液着色结果：菌体染成红色 鞭毛染成淡红色 临床意义：非发酵菌鉴定17（五）荚膜染色 原理：细菌细胞壁外围的黏液层，不易着

4、色 （Tyler染液+硫酸铜）结果 菌体为深紫色，荚膜为无色或淡紫色。 18（六）特殊染色-墨汁染色19（六）特殊染色-墨汁染色20第二节 二 细菌分离培养和鉴定21分离培养是微生物学检验中确诊的关键步骤培养基的种类和选择分离培养生化反应鉴定22基础培养基营养培养基选择培养基鉴别培养基特殊培养基培养基的种类-按用途23含基本营养成分： 蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠、琼脂肉汤浸液培养基：一般细菌都能在此培养基内生长营养琼脂培养基：一般细菌培养使用蛋白胨水培养基：靛基质实验培养基的种类-基础培养基24加入特殊成分血琼脂培养基：苛养菌分离培养巧克力琼脂培养基：含V因子和X因子培养基的种类-营养培养基25

5、加入抑制剂、抑制杂菌如SS琼脂：胆盐、枸橼酸钠、煌绿培养基的种类-选择培养基26糖发酵管显色培养基 培养基的种类-鉴别培养基 加入底物和指示剂27液体 培养基:不含凝固剂（琼脂），用于增菌、纯培养。固体 培养基:含12琼脂，用于分离培养、纯培养。半固体 培养基:含0.30.5琼脂，用于动力检测、保种。 液体培养基 固体斜面培养基 半固体培养基培养基的种类-按形态28培养基的选择 根据标本来源和可能存在的病原菌291.血培养基（营养培养基）分离培养基可生长大部分细菌传代培养基溶血测定：细菌鉴定导向-溶血，菌落周围呈绿色-溶血，菌落周围透明带302.巧克力琼脂（营养培养基）31含V+X因子可生长苛

6、养菌奈瑟菌嗜血杆菌肺炎链球菌 3.麦康凯琼脂32选择性和鉴别培养基结晶紫和胆酸盐抑制阳性球菌检测是否乳糖发酵+：粉红色-：无色 4.伊红美蓝琼脂33选择性和鉴别培养基检测肠杆菌科细菌检测是否乳糖/和或蔗糖发酵+：深紫红色，伴金属光泽-：无色或淡粉红色5.SS琼脂34选择性和鉴别培养基检测沙门、志贺菌检测是否乳糖发酵+：粉红色-：无色检测是否还原硫代硫酸盐沙门菌产生硫化氢，和铁盐结合产生硫化亚铁（黑色） 6.MH琼脂35用于纸片扩散法药物敏感试验配方减少对药敏结果的影响大多非苛养菌可生长 7.沙保弱琼脂36用于真菌培养弱酸性、含糖平板、斜面、小培养 培养基的选择-以“痰”标本为例37第 一 部

7、分 小 结哪些细菌适合直接涂片（不染色）检查？不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确保你的染色技术操作正确，结果可靠？接种临床标本时依据什么原则选择培养基？38休息一会儿，马上回来 ！39细菌的分离平板划线分离法斜面接种法液体接种法穿刺接种法倾注培养法涂布接种法401、平板分区划线接种411.平板分区划线接种灵活掌握不同标本不同菌量污染程度431、平板分区划线接种三区、四区没有严格的定义若标本中含菌较少，一区、二区 （如脑脊液标本、关节腔积液等）若标本中含菌量多，四区、五区 （如粪便、痰液标本）以分离出单个菌落（colony）为目的441、平板

8、分区划线接种451、平板分区划线接种挑标本不能太多分离不纯的菌，挑菌量更要少平板琼脂浓度/硬度不够容易划破平板水分太多易形成菌落蔓延462、斜面划线分离法473.半固体培养基穿刺接种法 保存菌种或观察细菌的动力和生化反应 4.液体培养基接种法 用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基的接种485倾注/密划平板法 用于饮水、饮料和尿液等标本中的细菌计数496.涂布接种操作程序50分离培养-气体环境需氧培养法：最常用二氧化碳培养法厌氧培养法51三、生化反应酶系统对底物的分解能力代谢产物 掌握各种生化反应的原理和应用是细菌鉴定的基础52三 常用生化试验碳水化合物的代谢试验蛋白质和氨基酸的代谢试验碳源

9、和氮源利用试验各种酶类试验抑菌试验原理、培养基/试剂、应用531.碳水化合物的代谢试验 1.1 糖（醇、苷）类发酵试验原理： 酶分解糖类产酸、产气 培养基：含0.5%1%的糖 方法： 接种培养基 结果： 产酸，培养基中的指示剂呈酸性反应（黄色） 产气，培养基开裂、气泡 意义：最主要、最基本，尤其肠杆菌科541.1糖（醇、苷）类发酵试验55大肠杆菌伤寒杆菌副伤寒杆菌葡萄糖 +乳糖 - -56 1.2氧化-发酵试验（O/F）原理：氧化型-分子氧；发酵型-无氧降解；产碱型-不分解葡萄糖培养基：Hugh-Leifson培养基方法: 两支HL培养基，其中一只滴加无菌的液体石蜡结果：氧化型-仅不加石蜡的产

10、酸；发酵型-两支均产酸；产碱型-无变化意义：肠杆菌科与非发酵菌的鉴别：前者为发酵型，后者为氧化型 葡萄球菌与微球菌 的鉴别：前者为发酵型，后者为氧化型57 1.2氧化-发酵试验（O/F） 1.3 ONPG（半乳糖苷酶试验）原理： 半乳糖苷酶，分解ONPG生成黄色方法：0.75% ONPG溶液 结果：呈现黄色为阳性，一般20-30min内显色意义：快速及迟缓发酵乳糖的细菌为 阳性 不发酵乳糖的细菌为 阴性 主要用于迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定注意：该试验不一定与分解乳糖相一致，决定于细菌产生的酶及其活性59 1.3 ONPG（半乳糖苷酶试验）结果：呈现亮黄色为阳性，无色为阴性。601.4 七叶苷

11、水解试验原理： 分解七叶苷成葡萄糖和七叶素，后者与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应生成黑色化合物，使培养基呈黑色方法： 七叶苷培养基，培养后观察结果结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性意义：肠球菌 阳性 链球菌 阴性 肺炎克雷伯、阴沟肠杆菌 阳性611.4 七叶苷水解试验621.5 V-P试验原理：分解葡萄糖，丙酮酸-脱羧-乙酰甲基甲醇-氧化为二乙酰，与培养基中蛋白胨内精氨酸中的胍基作用，生成红色化合物，即为V-P试验阳性。奈酚可加速此反应。培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：待测菌接种于培养基结果：20min内出现红色为阳性， 如不变红色，35 4h 后仍不变红，即为阴性意义：本试验常与甲基红一起试

12、验，前者阳性则后者多阴性63不变红色，阴性-变红色，阳性+1.5 V-P试验641.6 甲基红试验原理：分解葡萄糖产生丙酮酸，后者进一步生成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的PH降至4.5以下，加入甲基红试剂后显红色即阳性。培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：待测菌接种于培养基结果：呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性，黄色为阴性意义：大肠、沙门、志贺、变形、枸橼酸杆菌等为阳性； 肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性65滴加甲基红指示剂数滴，立即观察结果1.6 甲基红试验66二 蛋白质和氨基酸的代谢试验 2.1 明胶液化试验原理： 明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体变为液体方法：待测菌接种于明胶培养基

13、，22 培养7天。若用35 孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察前先置4 冰箱30min再观察结果：培养基呈液化状态为阳性意义：多数假单胞菌能液化明胶，肠杆菌科细菌如：沙雷菌、变形杆菌、 阴沟杆菌等可液化明胶67阴性阳性2.1 明胶液化试验682.2 吲哚（靛基质）试验 原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂-柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚培养基：蛋白胨水方法：待测菌接种于培养基，35 培养24-48小时，沿试管壁缓慢加入吲哚试剂结果：于两者接触面出现红色为阳性，无色为阴性意义：肠杆菌科细菌的鉴定；大肠杆菌、产酸克雷伯为阳性692.2

14、 吲哚（靛基质）试验 702.3 硫化氢试验原理： 分解培养基中的含硫氨基酸，产生硫化氢，后者遇亚铁离子或铅则形成黑褐色的沉淀。培养基：醋酸铅培养基方法：待测菌接种于醋酸铅培养基，35 培养24-48小时观察结果结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性意义：沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、腐败假单胞菌为阳性712.3 硫化氢试验722.4 尿素分解试验原理： 尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性培养基：尿素培养基方法：待测菌接种于培养基，35 培养18-24小时观察结果结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性意义：变形杆菌、摩根氏、雷氏普罗维

15、登氏、克雷伯氏为阳性73阳性阴性阴性2.4 尿素分解试验742.5 苯丙氨酸脱氨酶（TDA）试验原理： 苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基形成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应培养基：苯丙氨酸琼脂培养基方法：待测菌接种于培养基，35 培养18-24小时，加10%三氯化铁试剂3-4滴，观察结果结果：肠杆菌科变形杆菌、普罗维登氏菌、摩根氏菌阳性752.5 苯丙氨酸脱氨酶（TDA）试验762.6 氨基酸脱羧酶试验原理： 氨基酸脱羧酶 ，分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳，使培养基变碱，使指示剂显色培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基方法：待测菌接种于培养基，并加入无菌液体石蜡，35 培

16、养18-24小时观察结果结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色，（指示剂为溴甲酚紫）测定管呈黄色为阴性；若对照管呈紫色则试验无意义意义：肠杆菌科细菌的鉴定772.6 氨基酸脱羧酶试验 结果：孵育后，对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性；若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则试验无意义，重新做试验。 氨基酸对照鸟氨酸赖氨酸鸟氨酸为阳性赖氨酸为阴性氨基酸对照782.6 氨基酸脱羧酶试验对照管的意义：防止氧化脱羧造成的假阳性在相对厌氧的环境下，培养基中微量的葡萄糖以发酵形式产酸，使对照管变黄，而脱羧管由于脱羧后产生胺类物质使产碱超过产酸，培养基则变紫如此可形成强烈对比，使结果容易判断

17、。79休息一会儿，马上回来 ！80三 碳源和氮源利用试验 3.1 枸橼酸盐利用试验原理：以枸橼酸盐为唯一碳源，分解枸橼酸盐，使培养基变碱培养基：枸橼酸盐培养基方法：待测菌接种于培养基35 培养18-24小时，观察结果结果：培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性，不变色为阴性意义：克雷伯菌属、沙门菌属常为阳性81深蓝色为阳性+ 绿色为阴性-3.1 枸橼酸盐利用试验823.2 丙二酸盐利用试验原理：利用丙二酸盐为唯一碳源，将其分解生成碳酸钠，使培养基变碱培养基：丙二酸盐培养基方法：待测菌接种于培养基35 培养18-24小时，观察结果结果：培养基由淡绿变为深蓝为阳性，无变化则为阴性意义

18、：肠杆菌科属间鉴别833.2 丙二酸盐利用试验84四 各种酶类试验 4.1 氧化酶试验原理：氧化酶使细胞色素C氧化试剂：1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺方法：菌落法、滤纸法、试剂纸片法。结果：10秒内呈深紫红色为阳性应用：肠杆菌科细菌与假单胞菌的区别，前者阴性，后者多阳性；奈瑟菌属、莫拉菌属也为阳性854.2 触酶试验原理：氧化氢酶催化过氧化氢生成水和氧，出现气泡试剂：3%过氧化氢溶液方法：取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加3%过氧化氢数滴结果：出现大量气泡的为阳性，不产生气泡或产少量气泡的为阴性意义：用于革兰氏阳性球菌的鉴别，葡萄球菌和微球菌为阳性，链球菌和肠球菌为阴性，肠球

19、菌可能会产少量气泡864.2 触酶试验874.3 硝酸盐还原试验原理：硝酸盐还原成亚硝酸盐和氨，有的细菌能使硝酸盐还原成亚硝酸盐，有的能使其还原为亚硝酸盐和离子铵，有的能使其还原为氮培养基：硝酸盐培养基试剂：甲（对氨基苯磺酸），乙（奈胺）方法：待测菌接种于培养基，35 培养18-24小时，将甲乙液分别加入培养基，立即观察结果884.3 硝酸盐还原试验结果：出现红色为阳性注意：若加入试剂后无反应，可能是硝酸盐没有被还原，试验阴性硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而致假阴性，此时要加入少许锌粉，若出现红色则为阴性，不产生红色则为假阴性，实际为阳性意义：肠杆菌科为阳性；铜绿、嗜麦芽能产生氮气；链球菌肠球

20、菌阴性，葡萄球菌阳性894.3 硝酸盐还原试验904.4 DNA酶试验原理：DNA酶使长链DNA水解，后者可被酸沉淀，在平板上加入酸后会在菌落周围形成透明环培养基：0.2%DNA琼脂平板方法：点种被测菌于上述平板， 35 培养18-24小时；用1mol/L盐酸覆盖平板，观察结果结果：菌落周围出现透明环为阳性意义：金黄色葡萄球菌、沙雷氏菌、变形杆菌阳性914.4 DNA酶试验924.5 凝固酶试验原理：致病性葡萄球菌；结合凝固酶、游离凝固酶；纤维蛋白原变为纤维蛋白使血浆凝固方法：1 玻片法检测结合凝固酶 兔血浆 2 试管法检测游离凝固酶 0.5ml兔血浆37 水浴3-4结果：玻片法中有明显颗粒样

21、凝集而盐水对照无凝集为阳性 试管法以血浆凝固为阳性意义：致病性葡萄球菌；金黄色葡萄球菌多阳性93阴性阳性4.5 凝固酶试验944.5 凝固酶试验954.6 CAMP试验原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的溶血毒素的活性，在两菌的交界处溶血力加强，出现矢形溶血区培养基：血琼脂方法：先以产溶血毒素的金葡菌划一横线接种于BAP，再将被测菌与前一划线作垂直划线接种，两线不能相交，0.5-1cm，37 培养18-24小时观察结果，设阴阳性对照结果：在两划线交界处出现箭头样溶血区为阳性意义：B群链球菌阳性，马红球菌出现反CAMP现象964.6 CAMP试验974.7 胆汁溶菌酶试验原理：胆

22、汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，使细菌发生自溶试剂：10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁方法： 平板法：滴加10%去氧胆酸钠一环于被测菌落上35 30min观察结果 试管法：0.9ml被测菌培养物加入10%去氧胆酸钠0.1ml后置35 水浴10-30min观察结果结果：菌落消失，或培养物变透明为阳性意义：肺炎链球菌阳性984.7 胆汁溶菌酶试验994.8 脂酶、卵磷脂酶、碱性磷酸酶主要用于厌氧菌的鉴定产气夹膜梭菌卵磷脂酶阳性中间类杆菌脂酶阳性致病性葡萄球菌硷性磷酸酶阳性，如金葡等100五 抑菌试验 5.1 O/129试验原理： O/129（二氨基喋啶）对弧菌属有抑制作用，而对气单胞菌属无抑制作用培养基；碱性琼

23、脂培养基方法：纸片法药敏 40ug/片结果：有抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药意义：弧菌、邻单胞菌敏感；气单胞菌属耐药1015.2 杆菌肽试验原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全敏感，而其他链球菌则耐药培养基：血琼脂方法：同纸片法药敏0.04U/片结果：10mm敏感；10mm耐药意义：A群链球菌敏感1025.3 奥普托欣Optochin试验原理：肺炎链球菌对Optochin敏感，其他链球菌无抑制作用培养基：血琼脂方法：同纸片法药敏 5ug/片结果：抑菌环直径14mm敏感；14mm耐药此时加做胆汁溶菌试验证实意义：肺炎链球菌对Optochin敏感103常用生化试验小结碳水化合物的代谢试验 6蛋白质和氨基酸的代谢试验 6碳源和氮源利用试验 2各种酶类试验 8抑菌试验 3 104细菌的