基因工程基本流程获取目的基因

1、关于基因工程基本流程获取目的基因第一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月2获取目的基因目的基因修饰、改良建立高效表达系统表达调控机制研究第二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月3鸟枪法cDNA法PCR扩增化学合成基因文库第三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月4鸟枪法（shotgun）用基因组中的随机产生的片段作为模板进行克隆第四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月5“鸟枪法”最初用于测定微生物基因组序列。近年来，美国塞莱拉公司利用改进的全基因组“鸟枪法”完成了果蝇和人类基因组的测序工作，证明了它在测定大基因组上的可行性和有效性。第五张，PPT共六十七页，创作于2022

2、年6月6鸟枪法基本程序机械切割片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控 部分酶切片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整1.目的基因组DNA片段的制备第六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月7根据外源DNA片段的末端性质、筛选方案和大小确定载体片段大小-噬菌体、YAC、BAC 筛选方案克隆载体：原位杂交或限制性酶切图谱表达载体：基因产物功能检测2.外源DNA片段的全克隆第七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月8根据筛选方案确定受体：大肠杆菌：原位杂交或限制性酶切图谱特异基因表达受体：基因产物功能检测第八张，PPT共

3、六十七页，创作于2022年6月9菌落原位杂交理想的探针是筛选的决定因素基因产物功能检测 依赖于筛选模型的建立，如酶的活性、抗生素抗性限制性酶切图谱 多次酶切筛选3.期望重组子的筛选第九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月10限制性酶切图谱第十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月11 例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将重组子用SalI切开，凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0kb大小区域内的凝胶块，回收DNA片段，根据目的基因内部的特征性酶重复酶切过程直至筛选成功第十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月12通过亚克隆在已克隆的片段上准确定位目的

4、基因，然后对目的基因进行序列分析，搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列4.目的基因的定位第十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月13 鸟枪法操作的改进-非随机鸟枪法前提条件：目的基因的酶切图谱已知目的基因两侧的酶切位点已知两个位点之间的距离已知如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率第十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月14鸟枪法的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识； 不能获得的最小长度的目的基因；不能除去真核生物目的基因的内含子结构第十四张，PPT共六十七页，创作

5、于2022年6月15cDNA法cDNAmRNA的互补DNA(complementary DNA)反/逆转录病毒基因复制和表达中间产物分离mRNA体外合成cDNA克隆进入受体细胞筛选含有目的基因的重组克隆第十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月161.mRNA的分离纯化利用多数mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。含有poly(A)的mRNA亲和层析低聚dT纤维素:用于poly(A)较长的mRNA多聚U琼脂糖:用于poly(A)较短的mRNA（20A）无poly(A)的 mRNA第十六张，PPT共六十

6、七页，创作于2022年6月172.双链cDNA的体外合成反转录酶1）cDNA第一链合成逆转录酶以RNA为模板，Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。 mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物第十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月18cDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。cDNA第一链5 cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5 3 2）cDNA第二链合成-自身合成第十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月19

7、核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5 3 cDNA第一链cDNA第二链5 3 5 3 第十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月20第二十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月212）cDNA第二链合成-置换合成RNaseH识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链第二十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月22mRNAcDNA3 5 反转录酶引物mRNAcDN

8、A第一链3 5 引物mRNAcDNA第一链3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶DNA 聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3 5 RNaseHDNA ligase去引物第二十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月23第二十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月24第一链合成完毕后，变性去除残留的mRNA，在cDNA的游离3末端添加Oligo dC，然后与人工合成的Oligo dG退火，形成引物结构，聚合第二条链。3）cDNA第二链合成-引物合成第二十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月25mRNA3 5 AAAAAAAcDNA第一链5 TTTTTTTT3 碱处理cDNA第一

9、链5 TTTTTTTT3 dCTP末端转移酶cDNA第一链5 TTTTTTTT3 CCCCCCC加入Oligo dG退火cDNA第一链5 TTTTTTTT3 CCCCCCCGGGGGGG5 3 聚合酶cDNA第二链cDNA第一链5 TTTTTTTT3 CCCCCCCGGGGGGG5 3 AAAAAAA第二十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月26双链cDNA的克隆克隆方案的选择标准与鸟枪法相同末端性质筛选方案片段大小第二十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月27cDNA重组克隆的筛选原位杂交产物功能检测差示法（差别杂交/扣除杂交）第二十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6

10、月28在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA种的总mRNA群体，其二是不含有目的基因mRNA种的总mRNA群体。通过这两种总mRNA（或是它们的cDNA拷贝）为探针的平行杂交，对由表达目的的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点；而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，便可以挑选出

11、含目的基因的菌落。差别杂交第二十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月29第二十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月30局限性差别杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰度的mRNA而言，这个缺点就显得更加突出差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片段，十分耗费时间和金钱第三十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月31原理：羟基磷灰石柱结合DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。（Hydroxylapatite column）扣除杂交第三十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月32从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA

12、。 将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。 不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。 用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。第三十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月33AAA组织B组织总mRNA（A）总mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA总cDNA第一链A杂交内含蛋白A 的cDNA羟磷灰石柱过柱吸收RNA-DNA单链滤过羟磷灰石柱BA第三十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月34PCR扩增法使用PCR法克隆目的基因的前提条件是： 已知待扩增目的基因或DN

13、A片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。The National Center for Biotechnology Information/NCBI: /genbankEuropean Bioinformatics Institute/EMBL-EBI: http:/www.ebi.ac.uk/DNA Data Bank of Japan/DDBJ: http:/www.ddbj.nig.ac.jp/index-e.html第三十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月351. 直接从基因组中扩增（1）提取基因组DNA作模板（2）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增适

14、合扩增原核生物基因。第三十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月36原核基因组部分原核细胞提取基因组DNAPCR扩增第三十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月37（1）提取基因组 total RNA（2）反转录合成总cDNA作模板（4）PCR扩增（3）根据目的基因序列设计引物2. 从mRNA中扩增: RT-PCR适合扩增真核生物基因。第三十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月38目的基因的引物1反转录成目的基因cDNA第一链目的基因的引物2目的 基因cDNA第二链PCRmRNA第三十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月39化学合成法1976年H.G. Khoran

15、a提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。化学合成目的基因的前提：核苷酸序列已知目前通用的合成方法： 固相磷酸三酯合成法第三十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月40核苷酸1的3-OH端在合成开始时就已经附着在惰性的固相载体上，同时它的脱氧核糖环的5-OH基团也已用二甲氧基三苯甲基(DMT)保护起来。这种固相载体典型的情况是使用可控微孔玻璃(CPG)。第四十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月固相磷酸三酯合成过程结果是全保护的DNA：5 DMT, 3固相支持物, 核苷酸之间对氯苯。最后脱保护。第四十一张

16、，PPT共六十七页，创作于2022年6月42合成的一个循环周期分为如下步骤：第一步，脱三苯甲基作用(detritylation)酸处理法，脱去与核苷酸1的5-OH基团偶联的保护基团DMT。在这种脱DMT反应中，常用的酸是二氯乙酸(DCA)或三氯乙酸(TCA)；第四十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月43第二步，偶联反应(coupling)。通过一种弱碱四唑(tetrazole)的催化反应，使加进来的第二个核苷酸(N2)同已附着在固相载体上的核苷酸1之暴露的5-OH基缩合；第四十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月44第三步，封端反应(capping)。由加入的乙酸酐(acet

17、ic anhydride)激发乙酰化作用，把所有的没有参与偶联反应的5-OH基团全都封闭起来；第四十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月45第四步，氧化作用(oxidation)。在核苷酸N1和N2之间新形成的3-5亚磷酸三酯键十分活跃。利用碘液催化作用，使之被氧化成为相当稳定的3-5磷酸三酯键。这也就是为何我们称这种寡核苷酸合成法为磷酸三酯法的原因。第四十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月46化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150200bp，而绝大多基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因第四十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月

18、47小片段黏接法预先设计合成12-15bp的片断，片段之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。因此DNA片段在退火时可以自动排序，最后用T4连接酶连接即可得到完整基因。化学合成DNA片断的组装第四十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月48T4 DNA连接酶完整的DNA双链退火第四十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月49优点：DNA片段小，回收效率高缺点：互补序列短，退火时容易错配第四十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月50补丁延长法目的基因的一条链分成若干40-50bp的片段，另一条链设计成与上述大片段交错互补的小片段（约20bp）DNA片段

19、在退火用Klenow将空缺处补齐，最后用T4连接酶修复缺口。第五十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月51退火KlenowT4 DNA连接酶第五十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月52大片段酶促法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。第五十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月53355353T4DNA连接酶Klenow片段引物第五十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月54 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，

20、这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。根据构建方法的不同，基因文库分为: 基因组DNA文库（genomic DNA library, 含有全部基因） cDNA文库（complementary DNA library, 含有全部蛋白质编码的结构基因） 基因文库第五十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月55 基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1-f)p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因 组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）基因文库的完整性第五十

21、五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月56例如：人的基因组是 3109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7104 bpN=ln (1-p)ln (1-f)=ln (1-99%)ln (1-f)=4.61GfN=4.61GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61Gf=4.6131091.7104= 8.1105第五十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月57cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%）: 某一种低丰度mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）N=

22、ln (1-p)ln ( 1- )1n1n第五十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月58例如：人的成纤维细胞中，每个细胞内不到14个拷贝的低丰度mRNA约占整个mRNA含量的30%，这种mRNA大约11000种，因此1nn=11000/30%=37000 =1/37000N=ln (1-0.99)ln (1- ) 137000=1.7105包含完整人成纤维细胞cDNA信息的文库需要17万个克隆第五十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月59 文库的质量标准1. 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力2. 载体的装载量最好大于基因的长度 ，避免基因被分隔克隆3. 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序4. 克隆片段易于从载体分子上完整卸下5. 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选第五十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月60制备原则：DNA片段之间存在部分重叠、大小均一（1）染色体DNA大片段的制备超声波 机械搅拌 物理切割法-平末端内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。 酶切法-粘性末端文库构建策略第六十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月61常用载体 （2）构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少