转基因技术原理与方法

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3、 转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。 转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。转基因的方法和原理目的基因制备和载体系统 几种有效的转基因方法转基因生物的筛选与鉴定基本步骤1.分离获得目的基因； 2.在体外进行DNA重组，将外源DNA连接到能自我复制又带有选择标记的载体上；3.将重组DNA转移入受体细胞； 4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆； 1、目的基因制备和载体系统目的基因来源：基因组DNA分离、化学合成、PCR扩增、cDNA文库及DNA文库中制得。 载体：质粒、噬菌体 、柯氏质粒

4、、YAC载体 等 工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶 等 1.目的基因的分离（1）已知基因的获得化学合成法PCR扩增（2）未知基因的获得构建基因组文库，筛选目的基因构建cDNA文库，筛选目的基因mRNA差异显示技术筛选差异表达基因差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因2.良好载体需要满足的条件1、必须有自身的复制子；2、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA的插入；3、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子；4、载体分子必须有足够的容量；5、可通过特定的方法导入细胞；6、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾

5、信号等DNA调控元件。质粒载体质粒（plasmid）是能自我复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在。 每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，它能帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。 高拷贝数的质粒，在宿主细胞中能达10100个拷贝；低拷贝数的质粒，在宿主细胞中只有14个拷贝。 质粒要成为克隆载体，就必须进行遗传改造，使之成为一个具有单一的限制性内切酶识别位点、多个选择性标记。质粒载体pBR3221.大小为4361bp，含有抗氨苄青霉素和抗四环素这样两个抗生素抗性基因 2.在四环素抗性基因内部，还具有BamH I、Hind 和Sal I 三个识别位点。 3.Pst I识

6、别位点在氨苄青霉素抗性基因4.pBR322带有一个复制起点，可以保证质粒只在大肠杆菌里进行复制功能。pUC19质粒长2686bp，带有pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子半乳糖苷酶基因（lac Z）的调节片段，一个调节lac Z基因表达的阻碍蛋白的基因lac I，还有多个单克隆位点。 pUC19的筛选将转化细胞涂布到含有氨苄青霉素、IPTG和Xgal的固体培养基上，那些带有自身环化质粒的细胞由于能够形成具活性的半乳糖苷酶，所以菌落是蓝色，如果插入有目的DNA片段，无法形成杂合半乳糖苷酶，菌落时白色的。噬菌体噬菌体染色体是长约49kb的双链DNA，该DNA的

7、两个5末端都是由12个bp组成的单链互补粘性末端，当噬菌体DNA进入宿主细胞后，这两个粘性末端互相结合，在连接酶作用下封闭成环在噬菌体基因组中位于左边的基因（A-J）编码噬菌体头部和尾部的蛋白质，中间的基因（J-N）与重组和生长过程有关，但与裂解生长过程无关，因此对裂解生长过程来说，中间区的DNA是非必需的，可以被缺失或置换，因此可以在这个区域克隆外源DNA，右边的基因涉及基因的表达、调节、DNA合成晚期功能调节以及宿主细胞裂解等。噬菌体载体分类：插入型载体和置换型载体。 插入型载体：具有单一的酶切位点，可供外源DNA的插入。 置换型载体：有成对的酶切位点，在两个酶切位点之间的DNA片段，可被

8、外源DNA片段置换。 噬菌体载体可以克隆较大DNA片段，最大长度约为24kb，只需将噬菌体DNA、尾巴和纯化的空的头，混在一起就可以在体外产生具有侵染性的噬菌体颗粒。柯氏质粒 Cosmid柯氏质粒可克隆携带40kb大小的DNA片段，并在大肠杆菌中复制保存，综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优点。 柯氏质粒上带有多个单克隆位（RE2），两个cos位点，DNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个cos位点之间还有一个限制性内切酶位点（RE1）。2、遗传转化的方法1、应用于植物转基因技术的方法2、应用于动物转基因技术的方法 植物遗传转化的方法（1）间接转化法农杆菌介导转化法 （2）直接转化法 A、 基

9、因枪转化法 B、 电击法 C、花粉管通道法 D、 PEG介导基因转化法农杆菌: used extensively for genetic engineering of plants. 包含Ti质粒 Tumor inducing plasmid (bacterial plasmid) T-DNA (Transferred-DNA), 可以转移进入植物基因组.Tumor induced byA. tumefaciens根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包括Ri质粒)上

10、有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代 。Ti PlasmidT-DNA regionLeft borderRight bordervir genesori已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。auxin农杆菌与植物细胞相互作用的机制 返回基因枪转化法由美国Cornell大学的Sanfor (1987)提出,它的主要原理是将包含目的基因的载体包被在微小的金属微粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加速微粒穿

11、透植物细胞壁,导入受体组织细胞内,然后通过组织培养再生出完整的植株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化.。返 回电击法的主要原理是将原生质体在溶液中与DNA混合,然后利用高压电脉冲作用,使原生质体膜的某些部位被击穿而产生可回复的小孔,外源DNA可通过小孔进入原生质体内,而且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力. 返 回 花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因转化. 返 回PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高p

12、H值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连,并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进入原生质体. 返 回 动物外源基因的导入方法 1）显微注射法 （microinjection） 2）逆转录病毒介导法3）胚胎干细胞法4）精子载体法 意大利Lavitrano等1989年首次报道利用精子作为载体获得了转基因小鼠。5）细胞核移植法277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。6）生殖细胞转染法 基因转移的方法1.细胞融合 1062.微细胞介导

13、的基因转移 106 3.染色体介导的基因转移 106 4.脂质体介导的基因转移 2104 5.磷酸钙沉淀物介导的基因转移 103107 6.显微注射DNA 110 7.电脉冲介导的基因转移 1030 8.激光，超声波介导的基因转移 10509.重组RNA病毒感染10100 10.重组DNA病毒感染 1003、转基因苗的筛选与鉴定培养过程中利用标记基因筛选标记基因选择标记基因(Slective gene)报告基因(Report gene)抗生素类选择基因抗除草剂类选择基因生物安全性标记类选择基因-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus)荧光素酶基因(Luc)氯霉素乙酰转移酶基因(Cat)绿色荧光蛋白基因(Gfp)例 Gus检测原理：葡萄糖酸苷酶基因（Gus），催化葡萄糖苷酯类物质水解。其中很多水解产物具有发色团或形成荧光物质。例：组织化学法测定Gus活性 作用底物为X-gluc,产物是一