分子生物学检验：重组质粒DNA的提取

1、重组质粒DNA的提取目的：1.掌握碱裂解法的原理 2.掌握重组质粒DNA的提取方法和操作原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在PH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以PH4.8的缓冲液NaAc/KAc调至PH至中性时，只有变性质粒可复性，通过离心，可与其他物质分离。器材与试剂：微量加样枪，高速离心机，恒温振荡摇床，蒸汽消毒器，涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱，Takara质粒抽提试剂盒标本：含PUC119+U6的大肠杆

2、菌操作：1.从平板上挑取单菌落接种至1-4ml的含有抗生素的液体培养基中，37 ，150rpm/h过夜培养，时间大概14-16小时2.取1.5ml培养液至1.5ml离心管中，12000rpm/s ，离心2min,弃上清。3.用250ul的Solution （含RNase A）充分悬浮细菌沉淀（注：不要残留细小菌块，可以振荡悬浮）4.加入250ul的Solution轻轻上下翻转混合5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液（注：不可振荡，时间短于min）操作5.加入350ul的4预冷的Solution，轻轻上下翻转混合5-6次，直至形成紧实凝块，然后室温静置2min6.室温12000rpm/s离心1

3、0min（此时4 不利于沉淀降解）7.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上8.将500ul的Buffer BL加入Spin Column中， 12000rpm/s离心1min，弃滤液9.将操作步骤6的上清液转移至Spin Column中，12000rpm/s离心1min，弃滤液操作10.将500ul的Buffer WA加入Spin Column中，12000rpm/s离心30sec，弃滤液11.将700ul的Buffer WB加入Spin Column中，12000rpm/s离心30sec，弃滤液12.重复步骤1113.重新将Spin Column 安置于C

4、ollection Tube上，12000rpm/s离心1min，除尽残留液14.将Spin Column 安置于新的离心管上，加入80ul Elution Buffer,室温静置2min（Elution Buffer预热至60）15. 12000rpm/s离心1min洗脱DNA质粒DNA的酶切电泳鉴定目的：1.掌握质粒DNA的酶切电泳 2.熟悉重组体的鉴定方法原理：通过酶切（双酶切法对质粒DNA进行酶切，然后用电泳鉴定酶切产物的纯度）器材与试剂：恒温水浴箱，微量加样枪，凝胶电泳装置，凝胶成像仪，EP管，BamHI,Hind,10M缓冲液，ddH2O,Goldview染料，琼脂糖标本：质粒PUC119,PUC(119-U6)操作：BamHI和Hind双酶切,反应体系： PUC119 PUC(119-U6)质粒 12 12BamHI 1.5 1.5E.coliR 1.5 1.510M缓冲液 2.5 2.5ddH2O 2.5 2.5总体积 20 20操作：37 下酶切2h,0.8-1.0%琼脂糖凝胶电泳质粒DNA和酶切产物，凝胶成像仪下观察结果思考除限制性内切酶鉴定重组体外，还有哪些方法？1.蓝