微生物实验操作指导手册：细菌代谢产物观察和生长现象、紫外线杀菌实验、革兰染色等实验

1、革兰染色目的：掌握革兰染色的原理及操作。材料：干净玻片，接种环，葡萄球菌和大肠杆菌18-24h培养后的混合菌液，酒精灯，一套革兰染液原理：主要为细胞壁结构的差异。G+三维肽聚糖结构的交联度大，通透性低，脂质少或无，酒精作用使孔径缩小；而G-肽聚糖为二维疏松结构，薄，外膜含大量脂质，易被酒精溶解，使细胞壁通透性增高，结晶紫-碘复合物被酒精溶解而脱色。步骤：1. 细菌标本的制作（1）涂片：无菌操作。取一接种环混合细菌悬液，涂布成直径约1cm的涂片，涂片应薄而均匀。（2）干燥：涂片最好在室温中自然干燥。必要时可将标本面向上，放在酒精灯上方微火处干燥。（3）固定：标本面向上，在酒精灯火焰外焰按钟摆的速

2、度来回通过3次，放置待冷后染色。固定的目的是杀死细菌，使细菌与玻片黏附较牢固。菌体蛋白质变性后，提高与染料的亲和力。2. 革兰染色 （1）初染：滴加结晶紫染液1-2滴于涂片上，1min钟后用自来水缓缓冲洗。（2）媒染：滴加碘液1-2滴，1min后用自来水缓缓冲洗。（3）脱色：加95%酒精数滴，摆动玻片使酒精与细菌充分接触，约20-30s后，立即用自来水缓缓冲洗。（4）复染：滴加稀释碳酸品红液，30-60s后，自来水缓缓冲洗。用吸水纸吸干后，用油镜观察。镜检后，载片放入消毒缸。 细菌特殊结构的观察目的：观察并掌握细菌的形态及特殊结构。材料：细菌鞭毛、芽孢、荚膜的标本片；革兰阳性菌、革兰阴性菌染色

3、标本片示教：革兰阳性菌：葡萄球菌，紫色革兰阴性菌：大肠杆菌，红色细菌鞭毛细菌芽孢细菌荚膜 细菌的分布目的：了解细菌在自然界中的分布情况。材料： 普通琼脂平板培养基、血平板、镊子、无菌棉拭子、革兰染液。操作步骤：1.空气中细菌的检查（1）采用沉降法：取普通琼脂平板培养基1只，任意置一处，启盖约15分钟，再盖上，37oC培养24小时，观察有无细菌生长。 （2）结果判定：培养基表面可见多种大小、形态不一的菌落。2. 皮肤表面细茵检查(1)采用涂抹法: 先在平板底面用记号笔分成两区，作标记，将未消毒的手指在平板的12处表面轻轻涂抹划线，然后用碘酒、乙醇擦拭手指皮肤，用消毒后的手指在平板另一12处进行涂

4、抹，操作完毕，置37培养24小时后，取出观察结果。(2)结果判定：培养基表面有几种大小及形态不同的菌落生长，注意比较消毒前后细菌的生长情况。 3.咽喉部细茵检查(1)用无菌棉拭子在咽喉部涂抹后，涂在血平板上，并划线分离，37oC培养24小时后观察结果。注意观察平板上菌落种类以及是否有溶血现象，并可挑取菌落进行革兰染色检查。口腔微生物检查也可用无菌牙签直接挑取少量牙垢，制成涂片，进行革兰染色检查。(2)结果判定：血平板表面有大小和形态不同的菌落，有的菌落周围可见溶血环。牙垢涂片镜检可见革兰阳性菌和革兰阴性菌。 紫外线杀菌实验目的：掌握紫外线杀菌的原理，熟悉紫外线杀菌实验的操作。材料：大肠杆菌，琼

5、脂平板，无菌回形状纸片，接种环，镊子，紫外灯.原理：紫外线波长范围为240280nm,最适的波长为260nm，这与DNA吸收光谱范围相一致。其杀菌原理是紫外线易被核蛋白吸收，使DNA的同一条螺旋体上相邻的碱基形成胸腺嘧啶二聚体，从而干拢DNA的复制，导致细菌死亡或变异。紫外线特点：紫外线的穿透能力弱，不能通过普通玻璃、尘埃。步骤：1.平板密集划线接种。2.在平板上贴无菌回形纸片。3.UV照射30min（打开平板盖子）。4.取出回形纸，将回形纸放入消毒缸中。5.37oC培养24h后观察结果。 细菌代谢产物观察和生长现象目的：掌握细菌代谢产物的检测和结果的判断。熟悉细菌在各种培养基中的生长现象。材

6、料：各种生化管，大肠杆菌、伤寒杆菌、产气杆菌、变形杆菌等。原理：不同菌的酶系统不同，对底物的代谢产物也不同，用生化的实验方法可将产物检测出来，从而对细菌鉴定。步骤：一、细菌代谢产物观察1. 糖发酵实验 将大肠杆菌、伤寒杆菌分别接种在葡萄糖发酵管内，37培养18-24h进行观察。培养基中指示剂为溴甲酚紫。如能分解葡萄糖，则产酸，培养基由原来的紫色变为黄色，记录符合为“+”。如同时还产生气体，则其中倒置的小管中有气泡出现，记录符合为“”。如能分解乳糖，则产酸，培养基由原来的紫色变为黄色，记录符合为“+”。如同时还产生气体，则其中倒置的小管中有气泡出现，记录符合为“”。如培养基未变色，仍为紫色，则表

7、明细菌不能分解乳糖不能分解乳糖。记录符合“-”。2.枸橼酸盐利用实验该培养基中提供的唯一碳源是枸橼酸钠。指示剂是澳麝香草酚兰。分别接种大肠杆菌和产气杆菌，37培养24h进行观察.若斜面有菌落出现，培养基由原来的绿色变为深兰色，表明细菌能利用枸橼酸钠，记录符合“+”，反之“-”。3.靛基质吲哚产生实验能产生色氨酸酶的细菌，可分解蛋白胨水培养基中的色氨酸，产生靛基质。将大肠杆菌和产气杆菌分别接种在蛋白胨水培养基中，37培养48h后，每管各加吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛）3-4滴，若出现红色化合物-玫瑰色吲哚，表明靛基质产生阳性“+”；反之为阴性：“-”。4. 硫化氢产生实验有的细菌能分解含硫氨基酸

8、（胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢。将大肠杆菌和变形杆菌分别接种在这样的培养基中，37培养18-24h。若培养基中出现黑色沉淀物即为阳性“+”，表明产生的硫化氢与培养基中的铅盐(或铁盐)结合，生成黑色的硫化铅（或硫化铁）。二、细菌生长现象1、在液体培养基上生长情况 (1)表面生长：液体清晰，细菌生长在液面形成菌膜。如枯草杆菌。 (2)混浊生长：液体均匀混浊，或有少量沉淀。如大肠埃希菌。 (3)沉淀生长：液体清晰，细菌生长在管底，形成沉淀。如链球菌。2、在固体培养基上的生长情况 (1)菌苔：在琼脂斜面培养基上长成菌苔。(2)菌落：在平板上形成肉眼可见的细菌集团，称为菌落。观察时要注意菌落的大小、形状

9、、表面形状、边缘是否整齐、透明度、颜色等，可作为鉴别细菌的依据之一。(3)色素：水溶性色素和脂溶性色素。3、在半固体培养基上的生长情况 有鞭毛的细菌，由于能运动，在半固体培养基内沿穿刺线弥漫性生长，使穿刺线变得模糊不清。无鞭毛的细菌，因为不能运动，接种生仍没穿刺生长，穿刺线与周围界限清楚。凝集实验（玻片法）目的：掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性，熟悉凝集反应的操作。材料：伤寒杆菌AF群O多价血清、志贺氏痢疾多价血清、生理盐水、未知菌、玻片。原理：颗粒性抗原（凝集原）与相应的抗体（凝集素）直接结合，在一定的条件下形成肉眼可见的凝集现象。如红细胞ABO血型的测定，测定细菌的细菌凝集实验。步骤：1

10、.取清洁载物玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。于第一格和第二格内各加约30ul伤寒杆菌AF群O多价血清及志贺氏痢疾多价血清，第三格内滴加约30ul生理盐水。2. 用接种环挑取待检菌种少许，分别均匀地涂抹于1、2、3格内的液体中。接种环每次使用前后均需经酒精灯火焰烧灼灭菌。3. 轻轻摇动玻片，数分钟后用肉眼观察结果，出现灰白色凝集颗粒者即为阳性反应；仍为均匀混悬液者为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。 沉淀反应（双扩散）目的：掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性，熟悉沉淀反应的操作。材料：干净玻片，玻璃蜡笔、打孔器、微量加样器、正常人血清IgG、羊抗人IgG原理：将抗原与

11、抗体分别加到电解质凝胶板相邻的两孔中，抗原与抗体双方自由扩散，在最适当比例处形成抗原抗体复合物（沉淀线）。步骤：1.制板：取干净玻片一片，用蜡笔分为三格，用吸管将45ml加热溶化的1.5%食盐琼脂充盈中格，制备琼脂板。2. 打孔：待琼脂板凝固后，用打孔器打孔。孔间距约为5mm。3. 封底：将打好孔的琼脂板凝板过火焰三次。4. 加样：用微量加样器在三孔中加入生理盐水，正常人血清IgG和马抗人IgG。每孔加入约10l。注意：加样时勿使液体溢出和孔内出现气泡。5. 扩散：将琼脂板放入湿盘内，置37温箱中（均保持水平位置），于24小时后观察结果。药敏实验(纸片法)目的：掌握纸片法药敏实验方法，熟悉微生

12、物培养，了解抗生素对细菌的作用机制。了解含药纸片的制备材料：大肠埃希菌，普通琼脂培养基，无菌镊子，打孔器(直径6cm)，抗生素纸片。原理：药物在琼脂上扩散，形成浓度涕度，在一定的浓度下，对细菌抑制或杀死，浓度过低，则不能抑制或杀死。从而形成一定大小的抑菌圈。步骤：1.平板上密集划线接种。2.贴4-5种含抗生素的纸片于平板上。药片与平板边缘相距至少1.5cm，药片之间相距至少2cm。3. 37oC培养24h后观察结果。测量抑菌圈直径大小，判断敏感性。 消毒剂对细菌的影响目的：掌握含药纸片的制备。熟悉微生物培养，了解消毒剂对细菌的作用机制。材料：大肠埃希菌，普通琼脂培养基，无菌镊子，打孔器(直径6

13、cm)，滤纸纸片(直径约6 mm)，70%酒精，金星消毒水，紫药水、红药水。原理：药物在琼脂上扩散，形成浓度涕度，在一定的浓度下，对细菌抑制或杀死，浓度过低，则不能抑制或杀死。从而形成一定大小的抑菌圈。步骤：1.平板上密集划线接种细菌。2. 将无菌干燥的滤纸片放入各种消毒剂中浸湿，在容器边缘沥干，即为含药的滤纸片。3. 将以上含药滤纸片贴于平板上，每块贴4种。药片与平板边缘相距至少1.5cm，药片之间相距至少2cm。4. 37oC培养24h后观察结果。测量抑菌圈直径大小，判断抑菌效果。油镜的使用和维护目的：掌握油镜的使用与维护，熟悉油镜的使用原理。材料：显微镜，拭镜纸，液体石蜡油，二甲苯原理：油镜的透镜极小，工作焦距最短，光线通过玻璃和空气，由于介质密度不同发生折射，射入镜筒的光线极少，视野暗，物象不清晰。如在玻片与镜头（透镜）之间加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可减少光线的折射，加强视野的亮度，获得清晰的物象。步骤：显微镜油镜的使用和维护1.将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。识别油镜头：标有100、OIL、HI等字样。2. 打开电源，用低倍镜对光，打开光圈，调节聚光镜的位置，使视野光线充足。3. 标本上加镜