遗传密码的破译中的一个问题

1、遗传密码的破译中的一个问题遗传密码的破译自从“一基因一酶”学说建立(1941年)以后，人们逐步地认识到基因和蛋白的关系。“中心法则”提出后更为明确地指出了遗传信息传递的方向，总体上来说是从DNA-RNAt蛋白质。那么DNA和蛋白质之间究竟是什么关系？或者说DNA是如何决定蛋白质？这个有趣而深奥的问题在五十年代末就引起了人们的极大兴趣。早在1944年理论物理学家ErwinSchriodinger发表的什么是生命一书中就大胆地预言，染色体是由一些同分异构的单体分子连续所组成。这种连续体的精确性组成了遗传密码。他认为同分异构单体可能作为一般民用的莫尔斯电码的两个符号：“”、“一”，通过排列组合来储存

2、遗传信息。此时遗传物质的化学本质尚未确定，同年Avery虽成功地完成了体外转化实验，但尚未改变人们认为蛋白质是遗传物质的传统观念。十年后DNA双螺旋模型才得以建立，在这样的背景下能将遗传信息设想成一种电码式的遗传密码形式，实在是一种超越时代的远见卓识。1953年双螺旋模型的建立，给予科学家们以很大的激励。破译遗传密码也就成了势在必行的工作。薛丁谔(ESchriodinger)(18871963)要破译一个未知的密码，一般的思路就是比较编码的信息，即密码和相应的译文。对于遗传密码来说最简单的破译方法应是将DNA顺序或mRNA顺序和多肽相比较。但和一般破译密码不同的是，遗传信息的译一蛋白的顺序是已

3、知的，未知的都是密码。1954年Sanger用纸层析分析了胰岛素的结构后，对蛋白质的氨基酸序列了解得越来越多。但是直到1965年前后经历了十年时间，多位科学家的执着研究才破译了遗传密码，其中最为重要的几项工作其思路之新颖，方法之精巧都闪烁着科学的智慧之光。一.遗传密码的试拼1954年科普作家Gamov,G.对破译密码首先提出了挑战。他以著有奇异王国的汤姆金斯等优秀的科学幻想作品而著称，具有丰富的想象力，但他不是一位实验科学家，所以只能从理论上来尝试密码的解读。他在Nature杂志首次发表了遗传密码的理论研究的文章，指出“氨基酸正好按DNA的螺旋结构进入各自的洞穴”。他设想若一种碱基与一种氨基酸

4、对应的话，那么只可能产生4种氨基酸，而已知天然的氨基酸约有20种，因此不可能由一个碱基编码一种氨基酸。若2个碱基编码一种氨基酸的话，4种碱基共有42=16种不同的排列组合，也不足以编码20种氨基酸。因此他认为3个碱基编码一种氨基酸的就可以解决问题。虽然4个碱基组成三联密码，经排列组合可产生43=64种不同形式，要比20种氨基酸大两倍多，但若是四联密码，就会产生44=256种排列组合。相比之下只有三联体（triplet）较为符合20种氨基酸。后来的实验证实这一推测是完全正确的。但人们不禁要问在三联体中的每个碱基作为信息只读一次还是重复阅读呢？Gamov也许是考虑到效率的问题，认为一个碱基可能被重

5、复读多次，也就是说遗传密码的阅读是完全重叠的，因此氨基酸数目和核苷酸数目存在着一对一的关系。这一假定非常简洁地解释了核苷酸间距和多肽链上邻接氨基酸的间距（0.36nm）之间显示了明显的相关性。若真如此，重迭密码对多肽链上氨基酸的序列就形成了一种限制。例如，具有完全重迭密码的密码子ATC,后面接着的密码子一定是TC开头，那么相应的氨基酸的顺序也会受到限制。再者若是重迭密码，那么任何一个碱基的突变都会影响到相连的3个重迭密码子，即三个氨基酸都会发生改变，但事实并非如此。1957年Brenner,S.发表了一篇令人兴奋的理论文章，他通过蛋白质的氨基酸序列分析，发现不存在氨基酸的邻位限制作用，从而否定

6、了遗传密码重迭阅读的可能性。同时人们也发现在镰刀形细胞贫血的例子中，血红蛋白中仅有一个氨基酸发生改变。说明Gamov的后一推论是错误的。这就是智者千虑，必有一失。很多著名的科学家也有过类似的失误。在资料较少的情况下，对未知的真理作出推断，难免会发生偏差，人们对他们的那种敏锐、大胆、睿智和创新的精神，巧妙的构思仍敬佩不已。二.三联密码的验证1961年Crick和Brenner,S.等设计了一个实验，有力地证实了三联密码的真实性。他们用T4染色体上的一个基因（rll位点）通过用原黄素（proflavin）处理，可以使A插入或删除单个碱基，插入叫“加字”突变，删除叫“减字”突变，无论加字和减字都可以

7、引起移码突变（图14-1）。Crick小组用这种方法获得一系列的T4“加字”和“减字”突变，再进行杂交来获得加入或减少2个、3个不同碱基数的系列突变。悉尼布雷内（S.Brenner,）（1927）开始用原黄素诱导的突变称FCO,它们只能在E.colB菌株上生长形成噬菌斑，而不能在K菌株上生长，然后他们再用原黄素诱导产生回复突变，在E.coliK（九）菌株中出现了噬菌斑。用遗传学的方法和野生型杂交分析这些“回复突变体”，发现它们并不是真正的野生型。表明此回复突变并非是突变位点又精确地回复到原来的状况，实际上这种所谓回复突变是在不同位点发生第二次突变而引起的。这种第二次突变“抑制”了原来FCO的表

8、达。这种突变称校正突变或抑制突变（suppressormutation），它可抵消或抑制前一次突变的效应，校正突变的特点如下：校正突变是在第一次突变不同位点发生的。因此原来的突变可以通过野生型和回复突变型之间的杂交又恢复为突变型（图14-2）;校正突变或发生在同一基因中，称基因内抑制，或发生在不同基因中，称基因外抑制。不同的抑制其作用的方式不同。如有的抑制是在转录和翻译水平，有的可能是通过生理功能来实现的。mRNA上的3个碱基作为一个密码子（codon），头3个就读成第一个字。当原黄素诱导使DNA上的增加或减少了单个碱基将会使阅读框移动，导致“错误”，这样的移框突变可能导致遗传信息变成“无义”

9、的。若第二次诱变相应地插入或缺失一个碱基可以恢复正确的阅读框。通过这样的方法他们发现加入或减少一个和二个碱基都会引起移码突变，而加入或减少3个碱基时反而可以恢复正确的读框，表明每个密码的确是由3个碱基组成的。在这篇文章中Crick对遗传密码提出了4个特点：3个碱基一组，编码一个氨基酸密码是不重迭的（实验证据来自Wittmann等的实验及TsugitaA.，Fraenkel-ConratH用亚硝酸诱发烟草花叶病毒TMV产生的突变体的研究中得到的）；碱基的顺序是从固定起点解读的，即mRNA具有固定的阅读框；密码子是简并（degeneracy）的,即某个特定的氨基酸可以由几个密码子来编码。三用突变来

10、解读密码Tsugita,A.,Fraenkel-Connrat小组和WittmannH.G.小组试图通过用亚硝酸来对TMV进行诱变。当时（1960年）已搞清了TMV肽链的一级结构由158个氨基酸组成，将突变型和野生型进行比较就能确定肽链上氨基酸取代的位点和类型。当时根据亚硝酸诱变的原理，推测诱变的产生必定是由于mRNA中的AG或CU的缘故。那么取代与被取代的氨基酸之间，一定有两个碱基是相同的，而第三个碱基原来的氨基酸应是A或C，也有可能A，C都有，而取代的氨基酸的第三个碱基应为G或U。他们一共获得了约200个突变株，经反复比较分析结果破释了少数几个密码子，离全部破译尚有很大的距离。但他们直接地

11、证实了密码子是不重叠的。若当时可以测序的话，用这一方法是可以破译所有的密码子。四细胞系统的建立1959年，克里克和布伦纳（S.Brenner）在理论上确立了遗传密码由三个连续核苷酸构成，即三联体密码，并于1961年用一个设计精美的实验证实了这种推测，但却无法进一步提供证据说明具体的遗传密码。就在1959年，尼伦伯格也对遗传密码产生了巨大兴趣，部分原因在于这个问题充满了挑战，极大地吸引了他的求知欲。尼伦伯格想知道RNA是否是遗传物质DNA与功能物质蛋白质之间的信使或者说中介分子，但是尼伦伯格未受过正规的分子遗传学训练，只是业余时间学习了少许相关知识。因此，他开始向周围有相关研究背景的同事请教。当

12、同事获知尼伦伯格的研究计划时，都纷纷劝他放弃，他们认为对于缺乏分子遗传学背景的生物化学家而言，开始一个全新领域显得非常幼稚，其中一个同事甚至认为尼伦伯格的决定无异于学术自杀。尼伦伯格仍坚持着自己的想法，着手进行遗传密码方面的研究工作，特别是I960年马特伊(J.Matthaei)的到来更是加速了遗传密码的研究。马特伊来自德国波恩大学，当时正在康奈尔大学进行博士后研究，他非常善于实验研究，熟练的操作对尼伦伯格的成功是一个极大保障。为了破译遗传密码，1961年尼伦伯格首先需要建立一个稳定的实验体系，而对生物化学研究背景的他而言，无细胞体系最为理想。在尝试了几种生物后，尼伦伯格最终选定大肠杆菌无细胞

13、体系作为研究对象。他首先想搞清楚的是DNA还是RNA直接指导了蛋白质的合成。尼伦伯格先制备了大肠杆菌无细胞体系.他们的方法是：去模板：用DNase处理E.col抽提物，使DNA降解，除去原有的细菌模板。在抽提物中含有核糖体，ATP及各种氨基酸，除mRNA以外，是一个完整的翻译系统。由于DNA被降解，所以不再转录新的mRNA，即使原来残留的的mRNA因其半衰期短，也很快会降解掉。加入polyU：Nirenberg成功地破坏了翻译系统中的内源mRNA，这样从理论上来说若加入任何外源mRNA就可以按新的信息合成蛋白。他们采用了多核苷酸磷酸化酶，仅以尿苷二磷酸为底物，人工合成polyU。当他们把人工合

14、成的polyU加入这种无细胞系统中代替天然的mRNA时，惊喜地发现果真合成了单一的多肽，即多聚苯丙氨酸，它的氨基酸残基全是苯丙氨酸，这一结果不仅证实了无细胞系统的成功，同时还表明UUU是苯丙氨酸的密码子。他们用同样的方法分别加入polyA，polyC和polyG结果相应地获得了多聚赖氨酸，多聚脯氨酸和多聚甘氨酸。从而顺利地破译了4个密码子。峑yr屈邀醜X塑竝般Hl姑笨丙如KC炸半统氮战114-11並白欣怵外合成的实般示意阳按比例加入2种核苷混合的多聚物因当时还未分离RNA聚合酶，无法按设计的模板来合成RNA，但除了UUU,CCC,AAA,GGG以外，还必须破译其他的密码，Nirenberg又想

15、出了一种新的方法，就是按一定的碱基比例来合成RNA。比如在底物中加5份的UDP和1份的GDP，碱基比为U:G=5:1,它们能组成的三联体不外乎8种：UUU,UUG,UGU，GUU，GGG，GGU，GUG，UGG。U和G将随机地加入到三联体中，但各个位点上进入U和G的概率不同，如UUU:UGG=（555）:（511）=25:1；同理UUU:UUG=5:1,根据这样的推测，在无细胞系统中以这种比例合成的mRNA产生的氨基酸的比例也应是相应的，这样可以推测出密码子的组成。如氨基酸测定结果：苯丙氨酸（UUU）:半胱氨酸（UGU）=5:1苯丙氨酸（UUU）:缬氨酸（GUU）=5:1苯丙氨酸（UUU）:甘

16、氨酸（GGU）=24:1苯丙氨酸的密码子是已知的，由3个U组成那么半胱氨酸一定是由2个U，1个G组成；缬氨酸同样如此;甘氨酸应是由一个U两个G组成Ochoa,S.及其合作者获悉Nirenberg用polyU大获成功之后，利用身边保存着多种多聚核昔酸也开展了破译密码的研究，采用的方法也是加入不同比例的混合多核昔酸两组展开了激烈的竞争，经过两个组一年多的努力，结果搞清了各种氨基酸的碱基组成，但是并不知其顺序。Nirenberg于1964年又采用三联体结合实验，一举破译了所有密码，取得了重大的突破。五.三联体结合实验从上面的实验结果不难看出，按比例合成RNA的方法不能解决最关键的顺序问题，此时擅长R

17、NA合成的.Khorana,G.就担负起直接合成有序多核昔酸的难题，1964年正当Khorana刚刚奋力完成了第一批排列的核糖多核昔酸时，Nirenberg又有新的突破，使破译密码的艰难工作迅速达到了光辉的顶点，这种新的突破就是建立了三联体结合的新方法。这个方法的思路是建立在两项基础上的：tRNA和氨基酸及三联体的结合是特异的；上述结合的复合体大分子是不能通过硝酸纤维滤膜（NC）的微孔，而tRNA-氨基酸的复合体是可以通过的。Nirenberg采用了一把钥匙开一把锁的思路，进行破译密码。他们首先发现当简单的特定的核苷酸加入到E.col的核糖体上时，它们并不促使蛋白质的合成，而引起了特定的tRN

18、A及其携带的氨基酸结合到核糖体上，形成大的复合体。因此他们每次在无细胞系统中仅加一种已知顺序的三联体RNA（如ACA），同时在氨基酸中只用1C标记一种氨基酸（如Ser），若ACA进入核糖体后，tRNA上携带的不是所标记的Ser，那么tRNASer和其携带的Ser就不能与核糖体上的ACA特异结合形成大的复合体，而从NC上透过，所以通过测定透过NC的tRNA-aa小复合体是否带有标记，如带有标记就可以确定输入的三联体ACA不是Ser的密码子；那么就可重新输入另外的三联体RNA，一直到tRNA所带有的标记的氨基酸不透过NC，说明此三联体RNA正好是标记氨基酸的密码子（图14-3），就这样Nirenb

19、erg小组一举破译了全部的密码。六利用重复共聚物破译密码1965年Khorana以不同的思路和方法也巧妙地破译了全部的密码，他发挥了自己合成RNA的特长，用已知碱基组成二个、三个或四个碱基合成重复共聚物mRNA，在体外翻译系统中加入同位素标记的氨基酸，然后分析所合成多肽的氨基酸顺序，再进行比较分析。Khorana采用了有机合成一条短的单链DNA重复顺序，然后用DNA聚合酶1合成其互补链，再用RNA聚合酶及不同的底物合成两条重复的RNA共聚物（图14-4），作为翻译的mRNA，加入到体外表达系统中，根据合成的肽链的相应顺序来推测各氨基酸的密码子，如表10-1所示。当重复顺序为（UC）n时，组成的

20、重复RNA无论怎么阅读，只可能是UCU-CUC，翻译的多肽也是由丝氨酸和亮氨酸之间排列的顺序，但尚不能确定这两种氨基酸的相应密码子。当重复顺序为（UUC）n时，无论怎么阅读，都只产生三种多聚氨基酸，即polySer,polyLeu和polyPhe，和第一次比较，只有一个密码子UCU相同，但同样都有Ser和Leu，所以仍不能确定。再看第三行重复顺序（UUAC）n,无论怎么读法，只会是四个密码子的循环；UUA-CUU-ACU-UAC，但合成的肽链中氨基酸三种，Leu-Leu-Thr-Tyr。将密码子和氨基酸与第二次作对照，彼此共有密码子CUU和Leu,所以可以确定CUU是Leu的密码子。那么第二栏

21、中既然CUU已知是亮氨酸，毫无疑问UCU是丝氨酸。第一栏中原来UCU-CUC难以确定那一个是Ser,那一个是Leu,现已确定UCU是Ser,那么余下的CUC定是亮氨酸了。Khorana就用这表14-1用二个或三个、四个核苷酸构造重复共聚体来确定密码子重复顺序可组成的三联密码多肽的氨基酸组成(UC)nUCU-CUCSer-Leu(UUC)n(UUC);(UCU);(CUU)polyPhe,polySer,polyLeu(UUAC)n(UUA-CUU-ACU-UAC)Leu-Leu-Thr-Tye种方法将所有的遗传密码都破译了。这项实验还同时证实了三联密码的正确性，以及兼并的存在。由于Nirenb

22、erg和Khorana二人在破译遗传密码研究中的卓越贡献，他们二人共同获得了1968年的诺贝尔生理或医学奖。遗传密码如表14-2所示。氨基酸缩写符号如表14-3所示。七终止密码子的确定1964年Yanofsky在研究E.coli色氨酸合成酶A蛋白时推测无义密码子(nonsensecodons)(即终止密码子)的存在。他的推测/是从两个不同的角度：一是为trpA编码的mRNA还编码了trpB，trpC，trpD和trpE。那么有可能在翻译时中途在某个位点(两个肽的连接处)停止，然后再从下一个新的起点翻译，这样使各个肽可以分开，而不至于产生一条很长的肽链。这就意味着终止密码子(stopcodons

23、)的存在。另一个角度是他发现E.coliTrp-的突变株是不能合成完整的色氨酸合成酶蛋白，但继续对它进行诱变可以得到回复突变。回复突变中有两种，一种是个别氨基酸发生了变化，而另一种是完全回复，没有任何氨基酸组成的变化，这表明,E.coliTrp-不可能是任何移码突变的结果，那么这类的突变很可能携带有阻止合成的无义密码子。直到1965年Weigert,M.和Garen,A由碱性磷酸酶基因中色氨酸位点的氨基酸的置换证明E.coli中无义密码子的碱基组成揭示了琥珀和赭石(ochre)突变基因分别是终止密码子UAG和UAA。当时64个密码中的61个已破译，只留下了UAA、UAG和UGA有待确定。Gar

24、en等为了鉴定无义密码子采用了和Brenner相似的策略。他们从E.coli的碱性磷酸酯酶基因（phoA）中的一个无义突变品系中分离了大量的回复突变株，然后来比较分析。结果从图14-5中可以看出无义密码子是从该基因的色氨酸位点的密码子产生的。在回复突变中，无义密码子变成了Trp、Ser、Tyr、Leu、Glu、Gln和Lys的相应密码子。仅有Trp的UGG变成UAG,然后在此基础上回复突变成7种氨基酸，因此Trp产生的无义突变的密码子就是UAG。最后1967年Brennr和Crick证明UGA是第三个无义密码子。根据无义突变的三种昵称，三个终止密码子UAA叫赭石（ochre）密码子（相应于赭石突变）；UGA叫琥珀密码子（相应于琥珀突变）；UGA叫蛋白石（opal）密码子（相应于蛋白石突变）或乳白密码子。表14-2遗传密码第二位UCAG第一位UUUUPheUCUSerUAUTyrUGUCysU第三位UUCUCCUACUGCCUUALeuUCAUAA终止UGA终止AUUGUCGUAG终止UGGTrpGCCUULeuCCUP