靶向血管紧张素Ⅱ受体基因的短发夹RNA的功能比较

1、靶向血管紧张素受体基因的短发夹RNA的功能比拟邱龄，肖传实，曾秋棠，李茂莲【关键词】RNA干扰；高血压；血管紧张素受体；载体GenesileningtargetedttheratAT1reeptrsbyeffiientshRNAsanditssreening【Abstrat】AI:TinvestigatetheeffiayfshrthairpinRNAs(shRNAs)tdulatetheexpressinfratangitensintype1(AT1)reeptrgeneinaalianellsandtexplretherrelatinsbeteenthefeaturesfeffiients

2、hRNAsandshRNAsfuntinality.ETHDS:egenerated4shRNAsexpressinvetrstargetingagainstratangitensinreeptrs.TheshRNAseretargetedt4differentreginsfthesaegene.Therat6gliaellseretransfetedithnstrutedpGenesil1shRNAplasidandsrabledplasid.TheulturedellserelletedatdifferentphasesfrRTPRandesternbltanalyses.RESULTS:

3、24hlater,nsignifiantredutininAT1RNAlevelsatalltreatedgrupsuldbedeteted.48hlater,AT1RNAlevelfPbtreatedgrupdrpedt(55.77.6)%fthatinntrlgrup,andreahedthEirlestpintafter72h(43.78.2)%.NsignifiantinhibitinfAT1reeptrRNAexpressinasfundinthergrups(P0.05).TheAT1RNAandprteinlevelsbehavedultiatelysiilarly.Athur2

4、4and48,theAT1prteinas(46.94.2)%and(37.03.7)%respetivelyparedtntrlandaaxiuredutinasbservedafter72hinubatin(28.14.0%paredtntrls).NLUSIN:Besidessegeneralrules,ebelievethatthelpstrutureintheRNAattheregintargetedbysiRNAandthebetteraessibilityfthesiRNAttargetedRNAdhaveastrngeffetnsilening.【Keyrds】RNAi;hyp

5、ertensin;angitensinreeptr;vetr【摘要】目的：研究哺乳动物细胞中shRNA调节大鼠血管紧张素1型受体基因表达的有效性并探究有效shRNA的特征与shRNA功能性之间的关系.方法：设计并构建四个靶向大鼠AT1受体基因不同区域的shRNA表达载体，转染大鼠神经胶质瘤6细胞，并在不同时相搜集转染的细胞，进展RTPR和esternblt检测.结果：转染24h之后，各处理组均未见AT1RNA程度有明显减少.与对照组相比，Pb组在转染后48h血管紧张素受体RNA基因程度下降到55.77.6%，72h后到达最低点43.78.2%.其它组AT1受体RNA表达无明显抑制(P0.05)

6、.抑制大鼠血管紧张素受体RNA基因及其蛋白的结果类似.与对照组相比，Pb组血管紧张素受体蛋白在24h和48h分别减少至46.94.2%和37.03.7%，最大减少在转染后72h28.14.0%.结论：选择有效的shRNA序列时，除了一般的原那么之外，靶位RNA的环状构造及siRNA是否能到达靶位对基因干扰实验能否成功具有重要作用.【关键词】RNA干扰；高血压；血管紧张素受体；载体基因干扰RNAinterferene可以特异性地靶向降解目的基因RNA，从而使组织或细胞中的靶基因表达减少或沉默1.在本实验中，我们采用RNAi技术，拟靶向降解大鼠神经胶质瘤6细胞中的血管紧张素1型受体AT1R的RNA

7、，选取并合成了多条编码大鼠AT1RRNA的短发夹RNAshRNA的核苷酸单链，退火形成双链构造并将其克隆进入质粒载体，在构建完成四条编码AT1RshRNA的表达载体之后，转染6细胞.根据不同核苷酸序列shRNA质粒在哺乳动物细胞内的功能表达，研究核苷酸序列及碱基不同的shRNA其靶向沉默大鼠AT1R的作用差异，探究挑选有效shRNA的原那么.1材料和方法11材料载体pGenesil1质粒购自武汉市晶赛生物工程技术，限制性核酸内切酶BaH，Hind，Sal，Pst购自大连宝生物工程;T4DNA连接酶及缓冲液购自NeEnglandBilabs公司;大鼠神经胶质瘤细胞株6细胞购自中国典型物保藏中心;

8、细胞培养液DE购自Hylne公司;转染试剂etafetaine购自德国Bitex公司.所有的DNA合成及引物合成效劳均由上海博亚生物技术提供.12方法121靶基因AT1RRNA的shRNA的构建在GenBank上选取大鼠AT1R的基因序列序列号N_030985，利用网上设计软件siRNATargetFinder，选取siRNA以碱基TT结尾、长度为21个核苷酸的序列，并且G含量最大不超过60%，剔除含有连续四个或四个以上的A或T碱基的核苷序列，并通过BLAST验证的靶基因核苷酸序列四条，化学合成编码shRNA序列的DNA前向和反向序列单链如下：靶基因核苷酸序列同时设计一对非特异性序列作为阳性对

9、照.将合成的shRNA序列退火，与线性化的pGenesil1质粒连接，转化并提阳性克隆，Pst和Sal酶切和测序鉴定证实.以上不同的靶基因序列质粒分别称为pGenesilAPa，pGenesilBPb，pGenesilP和pGenesilDPd质粒.122细胞培养及转染按2108/L密度以一样的细胞数接种培养板，过夜至细胞铺满50%60%.用etafetaine转染细胞，按16的比例，根据试剂提供商的转染方案进展转染.123RTPRAT1基因引物序列为：5TGTTTTTTTATATTT3,5TTTGTTGGTTATTTA3，内参GAPDH的引物序列为：5TTAAGGAAGTAAGG3,5TTA

10、GTGGGGTTGT3.反响体积25L包括5LDNA，各引物0.25L，1.5Lgl2，0.25LTaqDNA聚合酶，0.5LdNTP混合物和5L10缓冲液.反响条件:在94退火3in之后，9415s，5515s，7215s进展30个循环.毕后，产物上琼脂糖凝胶电泳.124esternBlt分析转染pGensilAT1shRNA质粒和对照质粒之后，不同时相收获6细胞.PBS液洗涤后，上样缓冲液溶解细胞.煮沸溶解液10in后，离心，取上清，弃沉淀物.确定蛋白浓度.电泳别离细胞溶解液，转膜.50g/L脱脂奶封闭后，参加抗AT1抗体11000和抗atin抗体11500室温下孵育1.5h，再参加二抗抗

11、兔HRP抗体孵育，增强型化学发光显色.统计学处理：根据RTPR和esternBlt分析结果，用图像处理软件IageTl3.0测灰度值，并与内参照相比得相对值.用SPSS11.5统计软件neayANVA进展组间方差分析.显著性程度为P0.05.2结果21不同shRNA表达质粒靶点及二级构造我们选择大鼠血管紧张素受体基因RNA序列的部分序列,即556575bp，469488bp，595614bp，663682bp,做为基因沉默靶位图1.构建了四条碱基序列不同的pGenesilAT1shRNA质粒，预计产生的短发夹RNA如图2所示.除在3端缺乏两个连续的胸苷之外，AT1shRNA的正义链与大鼠AT1

12、基因的RNA序列的靶位基因序列是一样，反义链与靶序列互补.其转录产生的RNA，预计可以折叠成短发夹siRNA.所转录出的shRNA在理论上应可裂解靶基因RNA，而经重新洗牌的对照质粒所转录出的shRNA那么不应对AT1受体基因产生有效的基因沉默效应.22AT1shRNA转染后AT1RNA程度和蛋白表达转染四组阳性质粒24h后，各组AT1RNA程度无明显减少.在48h后与对照组相比，转染Pb质粒组的AT1RNA表达程度下降到55.77.6%，72h下降到最低点仅为对照组的43.78.2%.转染重新洗牌的siRNA大鼠神经胶质瘤6细胞其AT1受体RNA表达程度无明显抑制(P0.05).结果提示，P

13、b质粒明显抑制了AT1受体RNA基因的表达，其它三组质粒抑制AT1受体RNA基因作用不显著图3，4.将抑制AT1受体RNA有效的Pb质粒进展esternBlt分析.在24h和48h，AT1蛋白的表达分别为46.94.2%和37.03.7%.与对照组相比，表达减少的最大时相在转染后的72h仅为对照组的28.14.0%.结果说明，Pb质粒转染的细胞，AT1蛋白程度下降.而转染重新洗牌的shRNA质粒和对照组那么并不能减少AT1基因的表达图5.所有的结果清楚说明，转染Pb质粒可以抑制AT1基因的表达.3讨论肾素血管紧张素系统其主要的效应分子血管紧张素具有调节血压、水钠平衡、神经功能等作用.研究证实，

14、血管紧张素参与了动脉硬化、心肌堵塞、血管和心肌重塑以及充血性心力衰竭的病理生理过程.血管紧张素通过直接激活AT1R并间接刺激一些生长因子和细胞因子的释放，诱导心肌细胞,血管细胞肥厚和增生2.同时也可刺激AT2，激活与AT1相反的生物学效应而导致血管扩张、缓激肽生成增加、抑制纤维化和血管重塑3.本研究构建AT1短发夹RNA表达质粒，试图用基因沉默技术抑制哺乳动物细胞的AT1RNA的表达，希望在阻滞AT1受体之后，通过血管紧张素对AT2的作用，到达血管扩张，降低血压、抑制血管重塑等目的4.实验结果说明，我们观测到AT1基因RNA的表达在早期即有减少，而随着RNA程度的抑制，相应的蛋白也有所减少.结

15、果说明，U6启动子驱动的shRNA序列可有效地和特异地抑制AT1基因在转染的6细胞中的表达.因此，通过shRNA的表达，在细胞中抑制与高血压病理生理相关的AT1基因的表达，有可能成为一种有效的治疗方法.目前尚无选择siRNA序列的共识性意见或标准5.为了优化siRNA诱导的基因沉默效率，许多研究小组对寡核苷酸长度、二级构造及siRNA双链的序列特异性进展了研究.普遍认为6，siRNA序列应在靶基因起始密码子下游100个碱基之后进展选择，应避开起始密码子的5或3端非编码区选择siRNA序列.选择的正义链序列应是AAN19TT，其中N代表任何核苷酸，即选择的siRNA应该有两个尿嘧啶核苷的3突出末

16、端.并且所选的siRNA的长度应是21个核苷酸.决定RNA干扰研究成功与否的因素还有很多，包括靶位在RNA三级构造中的位置、转染效率以及双链shRNA的特异性等7-8.在比拟本实验中设计的四条质粒时我们注意到，其中P和Pd的靶向裂解部位均位于靶基因RNA二级构造中的核心位置尤其以Pd明显，这可能是质粒转染细胞后转录产生的短发夹RNA在与RIS(RNA诱导的基因沉默复合物)结合后无法进入靶RNA裂解部位而导致实验失败的原因之一.而Pa和Pb的靶向裂解部位位于靶基因RNA二级构造中的外表位置，但质粒Pa也无效，分析可能的原因：质粒Pa的G含量偏低可以导致对靶基因RNA的识别效率的减少;与RIS杂交

17、效率的下降.除此之外，我们还发现Pb质粒裂解靶基因的部分二级构造比质粒Pa裂解的部位更松散一些，也就是前者靶位中的氢键相对弱于后者的靶位.在这些影响因素中，我们认为最重要的因素是siRNA能否进入靶位，而靶位中RNA的构造是否足够松散，允许siRNA与RIS复合体进展靶向裂解.总之，在进展短发夹RNA设计时，除了要遵循如靶序列应位于开放阅读框，而不能选择非编码区；G含量应在50%左右；避开起始密码子后至少100个碱基；搜索5AAN19序列并进展BLAST等一些普遍的规那么9之外，我们认为siRNA能否进入靶裂解部位并且靶位的二级构造是否松散是有效shRNA合理设计并获得实验成功的最重要的因素.

18、【参考文献】1FireA,XuS,ntgeryK,etal.PtentandspeifigenetiinterferenebydublestrandedRNAinaenrhabditiselegansJ.Nature,1998,3916669:806-811.2DinhDT,FrauanAG,JhnstnI,etal.Angitensinreeptrs:Distributin,signalingandfuntinJ.linSi(Lnd)，2001,100(5):481-492.3LevyBI.anAngitensinIIType2reeptrshavedeleteriuseffetsinardivasulardisease?IpliatinsfrtherapeutiblkadefthereninangitensinsysteJ.irulatin,2022,109(1):8-13.4Esler.ThesypathetisysteandhypertensinJ.AJHypertensSuppl,2000,13(6):99S-105S.5adhaR,KaulS,iyagishi,etal.KnhfRNAinterfereneandi