贴壁培养细胞表面形貌的扫描电镜观察

1、贴壁培养细胞表面形貌的扫描电镜观察【实验目的】了解扫描电镜生物样品制备的基本过程了解扫描电镜的基本操作【实验原理】扫描电镜的电子学系统电子枪组成部分为聚光镜和物镜等。由电子枪发射的电子束经聚光镜和物镜的汇聚作用形成了极细的电子束照射样品。在扫描线圈的作用下，入射电子束在样品表面作栅状扫描。由入射电子和样品相互作用所产生的二次电子经样品上方的光电倍增管检测并输出一电信号。该电信号由视频放大器放大后输入显像管的栅极，用来调制其亮度。由于显像管上某点的亮度由样品上对应点所产生的二次电子信号调制，所以在显像管上可以显示样品的表面形貌的图像。二次电子像的分辨力近似等于入射电子束斑直径，二次电子像景深大，

2、像的立体感强。二次电子像的反差由样品的表面形貌所决定。样品临界点干燥的原理：临界点干燥可以避免干燥过程中样品表面形貌受到破坏。当液体和气体二相体系的温度和压力增加时，气体的密度逐渐增高，而液体的密度逐渐降低。待温度和压力增加至特定值时，气体和液体二相的密度相等，两相之间的界面消失，表面张力等于零，该体系处于临界点。此后继续增大压力，体系中气体不会转变成液体从而可以达到干燥样品的目的。【实验仪器、材料、试剂及用品】一仪器：扫描电镜(HITACHIS-4800)、临界点干燥仪(HITACHIHCP-2)、离子溅射镀膜仪(EIKOIB-3)二材料：贴壁培养细胞(HeLa细胞和CHO细胞)三试剂：2.

3、5%戊二醛溶液、磷酸缓冲液、乙酸异戊酯、乙醇、双蒸水等四用品：培养皿、盖玻片、镊子、移液器、双面胶带、扫描电镜样品台等【实验步骤】1取材：用0.1M磷酸缓冲液洗净(两次)2固定：用2.5%戊二醛溶液室温于通风厨固定1小时。固定完后用0.1M磷酸缓冲液和蒸馏水充分洗净。脱水：洗净后用30%,50%,70%,80%,90%,95%,100%,100%乙醇逐渐上升脱水。每级各10分钟左右。干燥：进行自然干燥。喷镀：将已干燥好的样品用导电胶粘于金属的样台上,再一起置于真空喷镀仪真空罩中,进行喷镀金铂合金镀层。扫描电镜观察。实验结果】1.HeLa细胞与CHO细胞比较HeLa细胞表面具有丰富的微绒毛，形状

4、近似球星CHO细胞表面具有微绒毛，有些呈椭圆形，有些长圆形。2.自然干燥和临界点干燥细胞观察比较下面为自然干燥后观察的细胞，与上面的临界点干燥后细胞比较后可以看出自然干燥的细胞结构严重破坏，很难观察其真实结构；而临界点干燥后观察的细胞结构清楚。思考题】为什么选择CO2作为临界点干燥的工作介质？在自然干燥时，液体的蒸汽压大于空气的蒸汽压，由于表面张力的作用，细胞受外界液体往下的拉力，易破坏细胞表面的形貌，所观察到的二次电子图像就不能真实地反映出样品表面的形态信息。而在CO2的临界条件（31C和7.4MPa）下，液体的蒸汽压等于气体的蒸汽压,液体表面张力为0,细胞表面较好地保存其原始形态，所以选择CO2作为临界点干燥的工作介质。生物样品在扫描电镜观察前，为什么要进行金属喷镀处理？扫描电镜的原理是通过高能电子入射样品原子激发产生二次电子，通过收集二次电子的信息成像